Панно из шишек фото: Поделки из шишек своими руками. Что можно сделать из шишек для интерьера?

Поделки из шишек своими руками. Что можно сделать из шишек для интерьера?

Вы решили преобразить свой дом или квартиру, сделать их более уютными и красивыми? Тогда эта статья Новостного портала «Vtemu.by» придется Вам по душе. А поговорим мы на этой странице с Вами о том, как легко и просто сделать уникальные предметы интерьера своими руками из самых обычных еловых шишек.

Шишка – это материал, который сама матушка природа, не обделила красотой. А значит, из шишек, могут получиться красивые и модные объекты декора. В работе Вы можете использовать шишки натурального вида, а можете придать шишкам приятный цвет и вид при помощи акриловых красок.

Что же можно сделать из шишек своими руками для домашнего интерьера? Вы возможно не поверите, но сделать можно превеликое множество арт объектов.

К примеру, шишками Вы можете наполнить напольные стеклянные вазы, корзины, конфетницы и подносы.

Расставить шишки на книжных полках и тумбочках, развесить их на окнах и стенах, составить «цветочные» композиции, декоративные венки и яркие панно.

Ну, а теперь обо всем выше перечисленном наглядно и подробно!

 

Картина из шишек своими руками

Панно из шишек своими руками

Для создания, такого изысканного панно, Вам будут необходимы следующие материалы: рамка, кусок фанеры, акриловые краски, горячий клей и еловые шишки.

Прежде всего необходимо еловые шишки хорошо почистить и при необходимости промыть, а затем просушить.

Теперь при помощи острого ножа или ножовки по дереву отрежьте верхушку шишки. Каждую верхушку необходимо тщательно прокрасить акриловыми красками приятных цветов. Обязательно прокрасьте акриловой краской фанеру, чтобы в последствии она не просвечивалась сквозь шишки.

Теперь вооружившись горячим клеем пистолетом приклеиваем готовые разноцветные шишки к фанере. Стараемся размещать шишки как можно плотнее друг к другу.

Готовая картина из шишек станет прекрасным украшением абсолютно любой комнаты. Для того чтобы поддерживать панно из шишек в надлежащем виде, стоит периодически проходиться по нему пылесосом или метелкой для уборки пыли.

 

Композиция из шишек своими руками

От предыдущей поделки у Вас остались попки от шишек, так вот именно из них мы и будем делать следующую поделку для интерьера – композицию из шишек своими руками.

Для работы Вам будет необходима флористическая пена, красивый горшок, проволока, акриловая краска, искусственный мох и листва.

Кусок флористической пены поместите внутрь горшка.

Шишки необходимо покрасить акриловыми красками и прикрутить к ним проволоку, при помощи которой каждая шишка будет держаться в композиции в флористической пене.

Украсьте композицию искусственной листвой, мхом и цветами, которые так же необходимо поместить в флористическую пену.

Готовые композиции из шишек разместите на столиках, полках и тумбочках. Прекрасным образом подобные композиции будут смотреться на подоконниках.

 

Новогодний венок из шишек

Рождественский венок из шишек

Венок из шишек своими руками

Используя этот удивительный природный материал, шишки, вы можете сделать и роскошные венки по случаю празднования любого праздника.

На примере изготовления венка на Хэллоуин мы продемонстрируем как легко и просто сделать это модное украшение входных дверей.

 

Венок на Хэллоуин

Венок на Хэллоуин своими руками

Для изготовления венка вам будет необходим каркас. Каркас можно сделать из картона, пенопласта, проволоки и даже металлической вешалки для одежды. Каркас должен иметь круглую форму.

 

Теперь к каркасу при помощи горячего клея пистолета приклеивайте шишки как можно гуще. Готовую композицию можно покрасить краской любого цвета. В нашем случае это краска яркого зеленого цвета.

И так как у нас венок на Хэллоуин, то он должен быть устрашающим, а значит он будет выглядеть как монстрик. Из пенопластовых шариков делаем монстрику глаза, а из цветного картона вырезаем зубы и не забываем про модный аксессуар бабочку.

Для украшения рождественского и новогоднего венком Вы можете использовать елочные игрушки, мишуру, конфеты, декоративную бумагу, золотую и серебряную краску, еловые ветки, искусственный снег и т.д.

12 поделок из шишек на Новый 2021 год своими руками – Фото Креативные идеи

В любое время года, если есть желание, можно сделать оригинальные и красивые поделки для дома своими руками. Ну а какой самый простой природный материал можно найти круглый год? Правильно, это, конечно же, шишки. Не многие знают, что из шишек можно сделать интересные поделки на любой случай. Ваше желание и фантазия помогут украсить жилище и оживить интерьер для празднования Нового 2021 года. Ну а если вам ничего не приходит в голову, то смотрите 12 поделок из шишек, которые можно сделать своими руками. Они обязательно придутся по вкусу каждому!

Лучшие новогодние поделки из шишек

Несколько секретов, перед тем как использовать шишки:

• Что бы шишка раскрылась, нужно положить ее в тепло, а лучше всего поместите ее приблизительно на 30 секунд в раствор столярного клея, после чего хорошо просушите. Так вы сможете не только раскрыть шишку, но и зафиксировать ее форму, а также предотвратить деформации готовой поделки.
• Для того, что бы изменить форму шишки, нужно замочить ее в воде. Затем обмотать веревкой, придавая желанную форму, и высушить.

Благодаря этим маленьким секретам, у вас всегда будут получаться красивые и аккуратные поделки.

1. Новогодняя декорация «Разноцветные шишки»

Зачастую этот материал применяют , что бы украсить дом и интерьер на новогодние праздники 2021 года. Самая простая декорация — это золотые или разноцветные шишки.

2. Новогодний венок на двери из шишек

Новогодним венком из шишек, принято украшать входные или межкомнатные двери дома, стены. Кроме основного материала для создания венка также можете использовать сухие цветы, ленточки и прочее, благодаря чему вы создадите самый неповторимый шедевр искусства собственными руками. Читайте пошаговую инструкцию как сделать венок на Новый 2021 год.

3. Оригинальный шишечный шар

Этот шар получается прямо таки огромным, на фото он кажется по меньше. Его можно использовать и как новогодний декор, или же как простой декор дома.

4. Подсвечники из шишек

Можно просто вставить свечку в шишку, а можно поставить ее на красивое блюдо и добавить несколько разноцветных шишек. На фото изображены идеи поделок шишек со свечками.

5. Новогодний дед мороз из шишек

Из шишки можно сделать вот такого Деда Мороза, или любого другого персонажа. Такие поделки можно использовать как игрушки на ёлку. В этом деле главное — ваша фантазия и мастерство.

6. Лисичка из шишек

Пошаговая инструкция на фото.

Если вы хотите весело и с пользой провести время со своими детьми, то шишки, это именно то что вам нужно. К тому же, что бы их собрать нужно сходить в парк или в лес, а это еще и прогулка на свежем воздухе. Еще одно преимущество шишек. Ну а когда вы запасетесь эти замечательным материалом, остается одно — придумать идею красивой поделки из шишек своими руками.

7. Оригинальная корзина

Конечно же, что бы сделать такую красивую корзину как на фото, нужно потрать много времени и терпения, зато оно того стоит! Получается красивая поделка из шишек, которая может радовать глаз не только осенью, но и круглый год.

8. Ёжик из пластилина и шишек

Еще одна забавная поделка, которую можно сделать с детками своими руками. Эта поделка подходит на осенние выставки в детский сад или школу. Кроме шишек понадобятся дополнительные материалы: пластилин, каштаны, желуди и листья.

9. Рамка для фотографий

Весьма интересной будет смотреться рамка для фотографий, декорированная сосновыми шишками. Возьмите для работы следующие материалы: рамка для фото, шишки, декоративные элементы (стразы, ленточки и т.д), клей.

Пошаговый ход работы:

• По всей поверхности рамки приклейте шишки. Применяйте разные размеры и приклеивайте в хаотичном положении.Это придаст изделию необычный вид.
• Между шишками можно приклеить бантики из тонких ленточек, стразы, красивые бусины и т.д. Используйте минимум декора. Так будущая фото рамка будет смотреться более изысканно.
• Если покрыть поверхность чешуек крупной морской солью, то это создаст эффект снега. Приклеить соль можно с помощью клея. Дайте рамке время на сушку. Работа готова.

10. Горшок для цветов из шишек

Безусловно, идея такой поделки заслуживает внимания, но для её осуществления потребуется много качественных шишек практически одного размера, и самое главное много терпения и железная усидчивость.

11. Букет из шишек

Очень оригинальный новогодний букет их шишек, смастерив который Вы можете подарить его, даже на свадьбу. Также отлично подойдёт для тематических осенних и новогодних фотосессий.

12. Подвеска из шишки

Еще один простой вариант, как быстро и красиво сделать поделку, имея всего лишь одну шишку и ленту из атласа. Ну конечно же, что было вообще красиво и эффектно, лучше сделать несколько таких лет с шишками как изображено на фото.

Счастливого Нового 2021 года!

Панно из Природных Материалов [60 Идей Своими Руками] 2019

Прекрасное вертикальное панно из ракушек

Cделанное своим руками панно из природных материалов – это красиво и оригинально. Выбор материалов, который дает природа, огромен, а сделать красивейшее украшение интерьера или подарок близкому человеку можно и без траты больших средств.

Содержание:

Панно добавит домашнего уюта вашему интерьеру

Шикарная картина из кожи в морской тематике

Яркие аксессуары помогут разбавить однотонный интерьер

Панно из ракушек мысленно перенесет вас на морской пляж

Купить или сделать?

Панно из природного материала (на фото) это не просто украшение для дома, но и частичка души человека, который его делал. Просто купить в магазине приглянувшуюся картинку – это совершенно не то ощущение.

Красивое панно для вашего интерьера можно купить или сделать своими руками

Великолепный букет из цветов в панно из натуральной кожи

Панно из дерева, ракушек и звезд помогут подчеркнуть морской стиль интерьера

Все, что создано своими руками, дарит тепло и уют, делает стилистику помещения оконченной и целостной. Для того, чтобы панно действительно стало непременной частью комнаты, будь то кухня, спальня, гостиная или прихожая стоит тщательно подбирать тематику, цвета, материалы и даже размер поделки.

Перед началом

Эффектное панно с резьбой по дереву в интерьере столовой

Сделать панно из природного материала своими руками можно, но прежде, чем начать, стоит узнать обо всех нюансах создания картины. Так, по размерам панно может быть разным. Все зависит от того сколько есть свободного места и материалов для ее создания.

База

Обратите внимание! Панно на стену должно иметь жесткую основу, чаще всего такие делают на базе фанеры, картона повышенной плотности, древесно-стружечных плит.

Панно на стену должно иметь жесткую основу

Ткань с веселым принтом станет отличным фоном для вашего панно

В качестве базы могут быть использованы и любые другие материалы – ткань, кожа, вязаное полотно, но для того, чтобы панно держало форму нужна жесткая рамка. Причем основание может быть, как компонентом декоративного творения, так и просто основой для его создания, которая будет дополнительно декорирована.

Стильное настенное панно из специй

Некоторые особенности выбора базы:

1. Материал должен иметь необходимую плотность, чтобы он мог держать форму.
2. Гибкость – непременное качество для исключение крошения и разламывания при работе.
3. Поверхность должна быть такой, чтобы компоненты панно можно было крепить к ней.
4. Поддаваться резке без специальных материалов, если в задумке создать фигурную картину.

Техники выполнения

Прекрасное сочетание мешковины и ракушек в дизайне панно

Композиция с крекером и кофейными зернами отлично впишется в интерьер кухни

Перечислить и описать все техники выполнения панно практически нереально. Стоит вспомнить об основных, которые помогут сделать новогоднее панно из природных материалов.

• Декупаж – это техника, при которой на базу помещается изображение, которое украшается объемными элементами. Это могут быть засушенные листья, ракушки, камешки, ветки деревьев.
• Квиллинг – скручивание тонких и длинных полосок бумаги. Особая техника позволяет создавать уникальные и непохожие друг на друга произведения.
• Мозаика – эта техника подходит, если для панно используются кусочки стекла, дощечки, пуговицы и другие мелкие компоненты. При этом удастся создать действительно праздничное новогоднее украшение-панно.

Панно, выполненное в технике декупаж с эффектом состаривания

Великолепная композиция цветов из кожи

Техника квиллинг становится очень популярной

Осень — прекрасная пора для изготовления панно из листьев

Обратите внимание! Для того, чтобы картина получилась действительно красивой, необходимо каждый компонент мозаики размещать продуманно, предварительно выкладывая на холст без клеящего состава.

Красивое панно из камней

Панно, выполненное в стиле пэчворк

Домашние крупы отлично подойдут для изготовления панно из натуральных материалов

Несколько рекомендация по размещению панно

• Каждое помещение требует индивидуального подхода к выбору панно. В гостиной не очень органично будет смотреться «кухонная» тематика. Зато есть универсальная – пейзажи, они красиво выглядят в любой комнате.
• Блестящее, зеркальное панно стоит размещать так, чтобы на него попадал и естественный, и искусственный свет. Так получиться уравновесить и визуально гармонизировать помещение.

Настенное панно из белых веток отлично подойдет для гостиной в классическом стиле

Яркое панно в виде букета сделает ваш интерьер уникальным

• Настенное панно выглядит привлекательно, если вокруг него есть свободное пространство на стене, оптимально, чтобы отделка была однотонной.
• Не стоит создавать целые композиции из панно, фотографий и картин – всего должно быть в меру.
• Расстояние от пола до композиции – 1,7 м.

Мастер-классы по созданию панно из природного материала на тему зимы

Панно с зимней композицией в дизайне коридора

Перед созданием панно, необходимо разобраться в том, какие потребуются материалы, а для этого определить какой именно мотив преимущество присутствует на зимних/новогодних панно.

1. Зима – это снег, а значит, нужна имитация именно его. Отлично справятся с этой задачей манка и вата. Из первого материал можно создать снежный покров, из второго – кучугуры и объемные элементы.
2. Главный объект Нового Года – это ель, а она, естественно, зеленая. Для создания такого «изображения» можно использовать засушенные зеленые листья, лавр, ветки хвойных растений. Если панно объемное отлично имитируют хвою шишки, но их нужно окрасить в зеленый цвет.
3. Зимне-новогоднее панно не обойдется без украшений на елку, их можно сделать из засушенных цветков, их лепестков, ягод.
4. Деревья зимой – без листьев, поэтому воплотить их на панно будет нелегко, подойдут ветки, кусочки дерева.

Панно «Зима за окном»

Настенное панно с оленями, цветами и елками станет отличным новогодним подарком

Зимние панно – не настолько красочные (в сравнении с осенними или летними), но и в них есть своя прелесть.

Панно-елка

Прекрасное новогоднее панно с голубой елкой

Для создания понадобиться:

1. Плотный картон, можно упаковочный, лист белой бумаги А4.
2. Клей прозрачный, можно «Момент».
3. Ножницы и ткань. Последняя нужна для создания праздничного фона.
4. Засушенные листья и цветы.

На основу – картон, если он упаковочный, то есть коричневого цвета, необходимо наклеить лист бумаги. Сверху обтянуть выбранной тканью, при этом нужно загибать края за основу на 1,5-2 см.

Далее на листе бумаги нужно «собрать» елку (пока без клея), просто скомпоновав имеющиеся листья. На нижний ярус кладутся более объемные листы, и чем выше, тем тоньше листочки. Когда композиция подобрана, можно ее крепить к основе. Причем смазывать весь лист клеем не нужно, достаточно будет нескольких точек, так панно будет выглядеть естественней.

Изготовление елки на панно из ниток

Панно из натуральных материалов своими руками придаст уюта вашему интерьеру

Сборку начать нужно с нижнего яруса, завершающий компонент – это верхушка. Украсить ель стоит разноцветными мелкими цветами или их лепесточками. Теперь осталось только дождаться, пока панно просохнет и оформить его в рамку.

Зимний пейзаж

Настенное панно «Зимний пейзаж» в интерьере прихожей

Тут фантазия не ограничена, ведь создать можно самые разные пейзажи, основа – это снег, а дальше только фантазия. Для такого объемного панно понадобиться:

1. Основа – лист фанеры.
2. Бумага.
3. Клей ПВА и силикатный. Для создания аккуратного пейзажа на пистолете для силикатного клея должен быть острый носик.
4. Кисточка, гуашь.
5. Манная крупа.
6. Вата.
7. Шпажка.

Материалы и инструменты для изготовления основы панно

Если набраться терпением, то изготовление панно своими руками из природных материалов не составит трудностей

Первым делом нужно подготовить основание. Для этого нужно:

• Развести клей ПВА с небольшим количеством воды.
• На основу наклеить бумагу, при этом края ее немого заворачивать за основу.
• Подождать высыхания.
• Когда высохнет, тем же клеем покрыть всю поверхность и щедро присыпать манкой.

Нанесение клея

После просушивания – окрасить крупу в синий цвет при помощи гуаши. Далее сделать набросок будущего пейзажа. На нем могут быть деревья, дорога, домики и все, что угодно.

Далее в дело вступает силикатный клей, который необходим для контуров набросков. После необходимо заполнить клеем их внутренность. Теперь нужно действовать предельно аккуратно и быстро. На клеевую основу нанести вату тонким слоем. А при помощи шпажки выровнять контуры.

Обратите внимание! Для того, чтобы клей не высох, нужно исполнять каждый элемент поочередно.

Панно из природных материалов: вывод

Милое панно из кофейных зерен

Изготовление собственноручно яркое панно из натурального материала

Красивое настенное панно в морской тематике

Создать уникальное панно несложно, причем количество и цветовая палитра практически безграничны, так что с помощью наших советов и натуральных материалов Вам легко удастся создать уютную и теплую атмосферу в доме.

фото идеи красивых изделий и мастер-класс

Поделки из шишек можно использовать для оригинального оформления интерьера, так как это стильные элементы декора. Создание таких мелочей принесет максимум удовольствия. Этим же нехитрым занятием хорошо разнообразить досуг малышей.

Поделки из природного материала

Природный материал отличается своей уникальностью, поэтому каждая новая поделка будут выглядеть по-разному. При этом существуют самые разнообразные схемы изготовления игрушек.

Этот материал способен преобразовывать собственную форму в течение определенного времени. В большинстве случаев для создания оригинальной композиции необходимо, чтобы еловые или сосновые плоды держали форму.

Для фиксации формы используют специальный раствор. Его готовят на основе теплой воды (1 стакан) и столярного клея (2 ст. л.). Шишки должны побыть в этом растворе около 30 секунд, после чего их просушивают. Теперь готовое изделие не деформируется, так как является достаточно прочным.

В отдельных случаях для поделок нужны плоды с особыми формами, которые нечасто встречаются в природе. Однако выход из этой ситуации есть. Для этого природный материал деформируют. Их опускают в воду и оставляют там размокать на 20-30 минут. После этого следует материал зафиксировать веревкой так, чтобы держалась нужная форма. Далее их высушивают.

Изделия для детей

Поделки из сосновых и еловых шишек могут сделать и дети, и родители. Детская тематика очень популярна, поэтому на сегодняшний день существует большое количество интересных вариантов. Дети очень любят пластилин и работы, которые проводятся с его помощью. Именно его можно отлично компоновать вместе с шишками при создании настоящих детских шедевров, которые впоследствии могут выступать в качестве игрушек.

Один из вариантов – кукла. Помимо елового плода понадобятся следующие материалы (на 1 изделие):

• две спички;
• краска;
• пластилин;
• нитки;
• ткань.

Шишка в данном изделии будет туловищем. Сверху к ней крепят голову из белого пластилина. На ней из пластилина других цветов делают глаза, нос и рот, а также волосы. Сверху на локонах куклы будет шапка или другой головной убор. Его можно выполнить из ткани.

Руки делают из спичек, окрашенных в любой цвет. Крепить детали к еловой шишке можно с помощью пластилина.

Под Новый год дети ждут подарков, но не менее интересно будет создать их самостоятельно. Например, новогодняя елочка, украшенная мишурой. Для этого понадобится минимум материалов:

• вата;
• клей;
• краска.

В качестве елочки в данном случае выступит сама шишка. А вот над созданием украшений придется поработать. Из небольших кусочков ваты нужно сформировать шарики, а затем окрасить их в разные цвета. После высыхания такие игрушки крепят на ветки с помощью клея.

Еще один интересный вариант – пингвины. Чтобы их смастерить, нужны:

• сухие еловые плоды;
• стручки фасоли;
• краска;
• пластилин.

За основу берут шишки. Это будет туловище. Спереди материал окрашивают в белый цвет, а сзади и по бокам – в черный. Важно правильно расположить шишку: ее широкая часть должна быть сверху, а узкая – снизу. Голова выполняется из пластилина, на ней делают круглые белые глаза с голубыми зрачками, и яркий клюв. По бокам мастерят крылья из стручков фасоли, окрашенных в черный цвет.

Такие изделия очень легкие, а процесс изготовления настолько прост, что с этим справится даже маленький ребенок. Поэтому мастеру можно предложить изготовить зайчика. Шишка опять будет играть роль туловища, ее широкая часть должна быть внизу. Из пластилина делают лапки, голову и уши.

На голове должны быть следующие детали из пластилина:

• глаза;
• нос;
• рот;
• усы.

Интересные варианты

Поделки из шишек своими руками делают достаточно часто. Они могут быть самими разными. Однако можно воспользоваться уже проверенными вариантами. Популярными остаются игрушки из этого природного материала.

Например, сказочная фея. Для ее создания потребуются:

• атласная лента;
• пластилин;
• фольга;
• шелковые нитки.

Шишка – это туловище феи. Ее широкая часть должна размещаться вверху. С помощью пластилина крепят фольгу, которую вырезают так, чтобы создать имитацию воротничка. Далее из пластилина лепят лицо феи. Из ниток делают волосы. Из атласной ленты формируют бант, который крепят сзади, за спиной феи.

На этом создание поделки может быть закончено. Однако можно проявить фантазию и поработать над деталями, которые способны дополнить образ сказочной феи.

Поделки из шишек своими руками могут быть и более сложными. Например, можно создать сложную конструкцию белки. Такую игрушку хорошо разместить в детской комнате для декора. Для работы понадобятся: три еловые шишки и пластилин.

Идея заключается в том, что шишки будут выступать в качестве туловища (крупного размера), хвоста (среднего размера), головы (маленького). Скрепляют их между собой пластилином. Потрудиться придется над мордочкой белки: за основу берут еловый материал, дно обклеивают пластилином, сверху крепят глаза, нос. Из пластилина лепят лапки.

Используйте специальные схемы и проявляйте собственную фантазию!

Так, из еловых и сосновых шишек интересно создать ежика.

Для этой поделки необходимы:

• еловый материал;
• пластилин;
• сосновые иголки.

К шишке крепят удлиненную мордочку из пластилина, на которой располагают глаза и нос. А по всей ее длине нужно воткнуть иголки, которые также можно закрепить пластилином.

Просто и оригинально

Часто создаются поделки из шишек своими руками, фото которых вы можете увидеть в нашей статье. Одним из несложных вариантов является медвежонок. Для работы над ним понадобится только пластилин и шишка. К природному материалу крепят мордочку медвежонка и лапки из пластилина.

Панно из шишек делать очень увлекательно. В результате удастся получить достаточно интересную композицию. Нужны следующие материалы:

• рамка для картины;
• шишки;
• лента;
• клей;
• жатая бумага.

На рамку крепят ленты, на которых фиксируют еловые плоды. Дополняют композицию цветы из жатой бумаги. Можно проявить креатив и дополнить композицию различными бусинками, крупными булавками и прочими элементами декора.

Новогодние поделки из шишек могут быть представлены в виде различных мультяшных героев. Например, стоит заняться созданием лешего. Его лучше всего выполнять из сосновых шишек. Кроме них, понадобятся следующие материалы:

• пробка;
• краска черная;
• серые шелковые нитки;
• клей.

Сверху на шишку крепят пробку, которая выступает в качестве головы лешего. На ней краской рисуют лицо. Сверху делают волосы, которые крепят к макушке. В качестве одеяния этого персонажа на туловище размещают серые нитки, но негусто. Это позволит создать эффект паутины.

Самые различные поделки можно сделать из шишек, главное – подойти к этому творчески. Эта вещь может стать настоящим украшением любой комнаты или же игрушкой для ребенка.

Фотогалерея

Предлагаем вам просмотреть еще 28 оригинальных фото идей поделок из шишек.

Видео

Несколько отличных идей вместе с процессом создания:

Декор из шишек (72 фото) » НА ДАЧЕ ФОТО

1

Композиция из сосновых шишек

2

Елочные шишки в декоре

3

Подсвечники из природных материалов и пробок

4

Шишки в интерьере

5

Украшаем венок из шишек

6

Новогодний декор с шишками

7

Шишки в корзинке декор новогодний

8

Поделки из шишек

9

Гирлянда из шишек

10

Гирлянда из шишек

11

Еловые шишки в интерьере

12

Гирлянда из шишек ваты звезд

13

Украшения из еловых шишек

14

Вазы с шишками

15

Новогодние шишки съедобные

16

Новогодние украшения из сосновых шишек

17

Декорация из шишек

18

Шишки в интерьере

19

Суккулентов, хвойные

20

21

Шишек в понг

22

Поделки из шишек своими руками

23

Декор еловых шишек

24

Панно из шишек

25

Венок из сосновых шишек к новому году

26

Корзина из сосновых шишек

27

Интерьерные украшения из шишек

28

Шар из шишек

29

Декор с шишками

30

Шишки для декора

31

Венок из природного материала

32

Венок с красными ягодами

33

Декор из шишек

34

Поделка папа и сыночек из шишек

35

Гирлянда из шишек и листьев для детей

36

Декор из еловых шишек

37

Изделие из шишек к новому году быка

38

Гирлянда из шишек

39

Еловые шишки для декора

40

Композиция из шишек к новому году

41

Топиарий из шишек на террасе

42

Декор с шишками

43

Декор с шишками

44

ЕК-ожерелье из шишек

45

Украшаем дом шишками

46

Сумка из шишек

47

Елочные украшения из шишек

48

Декор из сосновых шишек

49

Шишка с мешковиной на елку

50

Декор из еловых шишек

51

Подсвечник из шишек

52

Новогодние композиции своими руками

53

Композиция из шишек

54

Декор с шишками

55

Ежик из шишек пошагово

56

На груди шишка из шишки течет

57

Декор с шишками на новый год

58

Шар из шишек

59

Композиция с шишками

60

Подвесной декор из шишек

61

Композиция из шишек

62

Подсвечник из натуральных материалов

63

Браслет из шишек

64

Новогодняя поделка из шишек в детский сад на выставку

65

Шишки в стеклянной вазе

66

Декор из шишек для сада

67

Декор из шишек

68

Рамки из не открытых шишек

69

Месяц звезда шишки

70

Декор с шишками на новый год

71

Новогодняя елка из шишие

72

Поделки из шишек для декора

Поделки из природного материала (70 фото)

Для того чтобы создать в своем доме уютную атмосферу, каждая деталь, предназначенная для украшения интерьера, должна четко вписываться в его общую стилистику. Подчеркнуть достоинство интерьера, выделив преимущества и скрыв недостатки, поможет декоративное звучание различных аксессуаров. Одним из таких творений домашнего искусства — являются поделки из природных материалов изготовленные своими руками. Из нашей статьи вы узнаете, как с помощью незамысловатых вещей, которые нас окружают, можно создавать изысканные украшения и оригинальные предметы декора. Приведенные ниже мастер-классы с фото и пошаговым руководством, а также различные идеи для дома, дачи, школы и детского сада, помогут вам с лёгкостью справиться с этой задачей.

Красивые поделки: делаем быстро и легко (фото)

Канзаши, топиарий, декупаж, кашпо, оригами — мир хенд мейда неустанно будоражит фантазию рукодельниц.

Разнообразные поделки из дерева, стекла, ракушек, крупы, кофейных зерен, макаронных изделий, бумаги, камней, гальки и другого природного материала помогут создать неповторимый уют и легкое романтическое настроение в любом интерьере.

Совет! Создавать разнообразные запасы для изготовления поделок из природного материала можно абсолютно из чего угодно, просто оглянитесь вокруг, наверняка у вас дома имеется множество подходящих для этого вещей.

Потрясающий настенный арт-объект сделанный из макаронных изделий различного вида

Лесной и кедровый орех, фасоль, гречиха, горох, кориандр, перец — являются отличным материалом для творчества

Необычное дерево из кофейных зерен станет прекрасным подарком на День Святого Валентина

Совет! Чтобы рукодельное творчество доставляло вам исключительно положительные эмоции, а процесс заготовки материала превратился в настоящий праздник, можно совместить приятное с полезным.

1. Будучи летом на море, запаситесь красивыми ракушками и меленькой галькой. Из них получаются отличные настенные украшение для дома.
2. Прогуливаясь по осеннему парку, дайте ребенку задание насобирать желудей, каштанов, разноцветных опавших листьев. Изделия из природного материала изготовленные детскими руками наделены особым теплом и любовью.
3. Ухаживая за собственным огородом, не поленитесь посеять семена сухоцветов. Они отлично хранятся зимой и станут идеальным подспорьем для творческих работ.

Забавные кактусы сделанные из обычных камней

Поделки из натуральной древесины

Дерево — красивый и податливый материал, завоевавший популярность дизайнеров, архитекторов и простых любителей домашнего рукоделия. Натуральный массив легко комбинировать с металлическим, стеклянным, пластиковым и каменным декором.

Деревянные поделки гармонично впишутся в уютную комнату стиля кантри, зададут тон брутальному стилю лофт, выгодно изменят классическую, скандинавскую, минималистичную обстановку.

Сделать своими руками стол из коряги непросто, понадобятся определенные навыки обращения с деревом и столярным инструментом

Оригинальная фоторамка из дерева

Предлагаем просмотреть универсальную подборку интересных изделий из дерева, которые способны преобразить дизайн любого интерьера, став его красивым и ярким акцентом:

Ветки деревьев

Ветки и прутики – утонченный природный материал, позволяющий создать множество оригинальных вещей для дома своими руками: люстры, настенные светильники, плафоны и абажуры, подсвечники, фоторамки, вешалки, изголовья кроватей и многое другое.

1. Окрашенные сухие ветки с множеством ответвлений придадут особого шарма гостиной, кухне, ванной комнате.
2. Симпатично смотрятся столики, светильники, полки, вазы, отделанные спилом.
3. Романтичное настроение зададут декоративные панно в виде сердца, птицы, звезды.
4. Притягивают внимание золотые, серебристые, белые, черные прутья, размещенные в прозрачной вазе с камнями.

Тонкие веточки идеально подойдут для создания стильной вазы

Ветви деревьев являются прекрасным материалом для создания поделок своими руками

Привнести разнообразия в ваш интерьер поможет яркая ваза из веток

Древесные спилы

Спилы деревьев помогают создать более крупные поделки: вазы, часы, рамки, стилизованные венки. Гармонично впишутся в интерьер деревянные кадки для цветов, полки, подставки под горячее.

Проявив немного фантазии, умельцам несложно будет соорудить из этих кругляшей необычную столешницу, зафиксировав спилы дерева на фанерном листе, заполнив пустоты стружкой и вскрыв лаком.

Из обычных и на первый взгляд непримечательных древесных спилов получается отличный элемент декора

Чтобы сделать такой цветочный горшок понадобятся клей и древесные спилы различных диаметров

Кора дерева

Кора — натуральный и доступный материал. Современные мастера используют кору березы для создания уникальных картин и аппликации. Кружки, корзины, туеса и короба из бересты прослужат не один десяток лет.

Поделки из природных материалов помогут не только раскрыть свой творческий потенциал, но и воплотить в реальность ваши интерьерные идеи.

Кора березы считается одним из самых любимых материалов, используемый для работы мастерами рукоделия

Лапти из коры лиственных деревьев станут лучшим подарком для страстных поклонников русской старины

Декоративный камень и галька

• Декоративный камень — необузданная мощь стихии, обладающая сильным зарядом, что сказывается на общей концепции дизайна приусадебных участков, внутренней отделки помещений.

Сундуки, шкатулки, вазы, наполненные галькой разбавят рутинную обстановку городских квартир и служебных помещений. Мелкие камни украсят стены, зеркала, ручки дверей, подставки для инсталляций, а также бутылки. Посмотрите примеры на фото.

Панно из разноцветных камней

Интересным решением станет подсвечник из стеклянной бутылки, заполненной ракушками с разноцветной галькой. Не менее красиво будут смотреться красивые камешки приклеенные на стену.

Необычно и изящно смотрится декоративный коврик, обклеенный плоской галькой, посаженной на силикон или специальный клей. С ним ваше крыльцо будет выглядеть стильно и красиво.

Создавать оригинальные композиции из камней смогут даже дети. Только перед этим вам нужно провести для них пошаговый мастер-класс.

Объемная живописная картина из гальки

Как сделать коврик из гальки? Очень просто. Приклейте камешки с помощью специального клея к резиновому основанию

Мозаика, роспись, резка по камню — отличный способ развлечь детей, создавая магнитики, цветочные композиции, деревья, кактусы в декорированных горшочках.

Совет! Окрашивать морскую гальку в один тон лучше всего с помощью специальных баллончиков, а вот наносить на них рисунки и тонкие линии нужно используя кисти-лайнеры.

Роспись камней акриловыми красками позволяет создавать невероятные по красоте композиции

В качестве материала для поделок из камней лучше всего подойдет морская галька, имеющая плоскую форму

Пошаговое руководство по созданию забавных божьих коровок из обычных камней

• Из разноцветных камней делают декоративные панно, статуэтки. Облицовка галькой стен, пола, каминов и подоконников — основа креативного дизайна ванной, кухни, туалета.

Картина из камней — уникальный предмет интерьера

Использование природных материалов в интерьере делает его особенным, роскошная вешалки из камней тому яркое подтверждение

Летние поделки из фруктов, листьев и цветов

Формирование бережного и заботливого отношения к окружающей среде формируют занятия с природными материалами. Важным этапом работы становится сбор, обработка и подготовка к применению летних даров.

Делать детскими руками красивые и оригинальные аксессуары для дома можно из:

• листьев;
• тополиного пуха;
• цветов;
• мха;
• семян.

Сухая трава, фрукты, цветы, плоды деревьев и семена растений позволяют создавать на осеннюю и летнюю тематику сложные объемные аппликации, уникальные и красочные композиции и прочие оригинальные арт-объекты.

Красочное панно из цветов и листьев

Листья фикуса и папоротника могут послужить отличным украшением для стены

Совет! Если для создания поделок из природного материала используется дерево (спилы, поленья, кора, веточки) перед началом работы его следует хорошенько просушить. Использование влажной древесины существенно сократит срок службы самодельных шедевров.

Идеи для создания осенних поделок

Осень — лучшее время для сбора фруктов, семян, овощей, а также жёлудей, шишек и каштанов. Опавшие листья, сухие цветы, трава послужат для создания необыкновенных букетов, венков, аппликаций.

Невероятно яркая, солнечная осенняя композиция из даров природы

Веселые поделки из тыквы подарят вам и вашим детям море позитива и прекрасное настроение

Натуральные композиции хорошо смотрятся в обычных вазах, арбузной кожуре, скорлупе кокоса, оболочке тыквы. Оригинальный мастер-класс можно провести детям, научив их создавать поделки из природных материалов своими руками.

1. Из шишек получится уютная корзиночка или венок, которые можно повесить на входную дверь.
2. Кабачки украшенные ягодами и цветами, станет главной героиней садового участка.
3. Калейдоскоп ярких красок тыквы, картошки, баклажан украсят дворовой ландшафт, если придумать им достойное применение.

Венок из шишек выглядят очень стильно и привлекательно

Идеи украшения приусадебного участка безграничны, главное не бояться экспериментов

Старый светильник приобрел вторую жизнь в виде оригинального украшения для стола

Совет! В поисках идей создания поделок для детского сада, обратите внимание на чудесные домики из коры и веток деревьев.

Поделки на тему: «Море и подводный мир»

Морские поделки дарят яркие эмоции и радужное настроение даже холодной зимой. Если повезёт собрать коллекцию ракушек во время отдыха, поспешите стать авторами объемных аппликаций, картин, рамок, морского театра или аквариума.

• Морские сокровища легко преобразуются в бусы, кулоны и подвески.
• Холодный фарфор, соленое тесто помогут дополнить композицию морскими звездочками, кораллами, цветными камешками.
• Океан в бутылке — целый подводный мир, позволяющий придумывать различные истории, изучать морских обитателей.
• В прохладный день тёплые воспоминания о лете также подарят кораблики из подручных материалов.

Морское произведение искусства

Изготавливая декора на морскую тематику ничем себя не ограничивайте — творите, пробуйте, дерзайте

При изготовлении изделий на тему «море» можно использовать абсолютно любой природный материал

Добавьте вашему дому частичку морской стихии

Перья для рукоделия

• Перья птиц — используются мастерицами для создания мягких подушек, теплых перин, украшений для шляп, игрушек, необычных сувениров.

Ими также украшают интерьер, дополняя поделки пайеткиами, блестками, маленькими бантиками из лент и прочим декором.

Окрасив кончики перьев в розовый цвет и объединив их в один букет, вы получите великолепное украшение для вашего интерьера

Несмотря на то что перо — очень капризный материал, работать с ним достаточно просто и легко

Ловец снов — магический талисман притягивающий удачу

Создать невероятно романтическую обстановку можно с помощью декоративных подсвечников, выполненных из стеклянных стаканов и красивых перьев

Чтобы создать подобную красоту понадобится целый набор уникальных широко- и узкоконечных перьев

Важно! Перья птиц могут стать причиной сильной аллергической реакции у человека, поэтому будьте осторожны используя их в качестве декоративного украшение для дома.

Поделки своими руками (пошагово)

Создавать своими руками поделки из природного материала легко — главное заручиться необходимым инструментом и материалом. Приведенные ниже пошаговые инструкции по созданию универсального декора для дома и дачи помогут вам справиться с этим простым заданием.

Красочное панно

Панно – декоративное украшение стен, потолков, фасадов. В настоящее время для его изготовления применят три основных жанра: скульптурный, мозаичный и аппликационный.

Интересным решением является художественное панно из природных материалов: сухих листьев, соломы, скорлупы орехов, сухоцветов. Его изготовление проходит в 3 простых действия:

1. Для начала нужно сделать основание. Изготовить его можно из деревянных досок сбитых в щит или куска фанеры.
2. Далее основание нужно обтянуть материалом из мешковины или сделать поверх него соломенную решетку, на которую будет наноситься аппликация. Сделать аппликацию можно из плоских элементов (листьев, зерен, семян), или получить рельефную поверхность, сочетая объемные детали. Необычным решением будет вплетение в соломенную сетку высушенных цитрусов, мха и листьев.
3. Финальный этап — создание веревочной или проволочной петельки для крепления панно на стене. Оцените результат на фото!

Совет! При желании к получившейся композиции можно добавить обрамление из коряг либо веточек лозы. Это сделает вашу работу более изящной

Яркий, осенний натюрморт из высушенного лимона идеально дополнит обеденную зону вашей кухни

Панно из природных материалов отличается разнообразием и красотой исполнения

Яичная скорлупа для комнатных растений

Создание небольших вазонов из яичной скорлупы требует особой осторожности, так как сама по себе скорлупа является довольно хрупким материалом и может легко повредиться при неосторожном движении.

Порядок действий:

1. Надколите верхнюю часть сырого яйца и вылейте содержимое в емкость.
2. Обработайте края до получения ровного среза или оставьте их надколотыми.
3. Придайте устойчивости вазам, воспользовавшись подставкой или упаковкой для яиц. Альтернативным вариантам может стать пластилиновый жгутик, дополняющий дно скорлупы.
4. Полученная емкость готова для рассады полевых цветов, зелени, мха, маленьких суккулентов.

Интересно знать! Яичная скорлупа также может стать изящным подсвечником, пасхальной поделкой или миниатюрной цветочной клумбой.

Симпатичные фигурки из яиц которые так и хочется съесть

Посредством обычной яичной скорлупы можно освежить и дополнить интерьер любой комнаты

Чтобы создать свой собственный мини-сад, вам понадобится совсем немного времени, главное все делать аккуратно и придерживаться описанных выше правил.

Сделайте оригинальный подарок для своей второй половины, создав красивую цветочную композицию из скорлупы яиц

Cказочный сад из свежей зелени

Подсвечники из спила

Подготовка эксклюзивного подсвечника из пня или древесного спила займет минимум времени и сил. Заручитесь необходимым материалом и инструментами для выполнения следующих действий:

1. Пропитайте деревянную основу составами, предупреждающими образование гнили, насекомых-вредителей.
2. Используя дрель и специальную насадку, сделайте неглубокое отверстие по центру пня, для установки стандартной свечи. Чтобы края не представляли опасность, обработайте их наждачной бумагой.
3. Украсте изделие мешковиной, подвязанной джутовой веревкой или красивой ленточкой.

Необычно будет смотреться деревянная подставка для 2-3 свечей, сделанная из простой коряги, закрепленной на стене, подвесах или опорах. Столь интересное рукотворное изделие станет лучшим атрибутом для романтических вечеров.

Высверливать сердцевину нужно на глубину высоты свечки, не более

Чтобы подсвечник выглядел привлекательно и эстетично кору с пня желательно снять

Красивый канделябр из веток прекрасно впишется в дизайн стиля кантри

Часы для кухник

Часы для кухни из столовых приборов делаются очень быстро и просто. Для этого нам потребуется:

• часовой механизм с красивым циферблатом;
• одноразовые пластиковые ложки и вилки;
• клей-пистолет.

Необычные часы из ложек и вилок помогут украсить интерьер кухни

Пошаговый мастер-класс

1. Для начала нужно разобрать часы, отделив механизм от циферблата;
2. Далее, используя клей-пистолет, приклеиваем импровизированные стрелки напротив каждой цифры таким образом, чтобы ложки и вилки чередовались и шли одна за другой. Так часы будут смотреться гораздо симпатичнее;
3. Осталось дать клею высохнуть, установить циферблат на место и вставить в часы батарейку. Оригинальный и полезный декор для кухни готов!

Процесс изготовления кухонных часов значительно упрощается, если использовать специально предназначенный для этого декоративные ложки и вилки

Подводим итоги

Декор для дома, дачи, школы, детского сада своими руками сделать несложно, тем более если использовать для этого природный материал, работать с которым одно удовольствие.

Вам лишь нужно заручиться помощью родных и близких, подключить воображение, и смело творить! Пробуйте, экспериментируйте, ищите свое!

Мастер-класс “Цветы и букеты из шишек” – Семейный портал Омской области

Середина лета и золотая осень с теплыми солнечными деньками – замечательные времена года. Пора собираться на прогулку с детьми и заняться сбором природных материалов для разных поделок. Сосновые, еловые, можжевеловые, шишки лиственницы – это потрясающее разнообразие пригодится вам для интересных вечеров с малышами. Выделите немного времени и создайте шедевр для детского сада, школы или просто для дома.

Изготовление цветов из таких материалов очень увлекательно. Взрослые и дети получат массу положительных эмоций!

Шишечные цветы вы можете прикрепить к шпажке или наклеить на панно. Добавляйте листики из бумаги и картона, засушенные листья деревьев, различный декор – ограничений нет! Ваша фантазия и немного терпения – и красивый букет будет готов!

Какие инструменты и материалы понадобятся

Применяя различные шишки, вы можете сделать что угодно!

Существует множество декоративных композиций, придающих уютную атмосферу интерьеру и освежающих его. Отнесем сюда декоративные новогодние венки, топиарии, осенние плоды, букеты из шишек и осенних листьев. Поделки могут быть любыми, вплоть до фигурок зверей – мишки, ежики, пингвины, совы. Ни один ребенок не сможет остаться равнодушным и наблюдать за процессом со стороны!

Для работы соберите весь необходимый материал и подготовьте инструменты:

• Несколько шишек различного размера.
• Веточки деревьев.
• Желуди, орехи, веточки засушенных злаков.
• Листья.
• Плоскогубцы.
• Проволоку.
• Клей-пистолет.
• Акриловые краски.
• Кисточки.
• Емкость для установки букета.
• Лак для покрытия шишек (можно обойтись и без него).

Подготовка шишек и листьев для работы.

Предварительно осмотрите все собранные трофеи для создания букета из шишек своими руками – поделка не может быть неряшливой. Возможно, природным материалам потребуется дополнительная обработка.

Если шишки очень грязные, необходимо хорошо их вымыть, а затем просушить на открытом воздухе. Те, что чище, просто тщательно высушите и смахните пыль кисточкой.

Каждую недозрелую и нераскрытую шишечку надо будет поместить в духовой шкаф, нагретый до 200 градусов. Не закрывайте дверцу – шишки раскроются.

Если нужны как раз нераскрытые чешуйки – смажьте шишку клеем и высушите.

Воспользуйтесь спреями с красителями, блестками. Пригодится и искусственный снег.

Собранные листья надо будет тоже подготовить, иначе они высохнут и покоробятся, а потом рассыплются на мелкие кусочки.

“Законсервируйте” их в растворе глицерина. Для состава придерживаются соотношения частей 1 к 2 – глицерин и вода соответственно. Листики укладывают в раствор на 4-6 дней, а затем сушат на воздухе. Результат – красивые глянцевые листья.

Быстрый способ подготовить их также существует. Для этого вам надо будет растопить воск или парафин и каждый листик окунуть в него, тут же вынуть и высушить. Уложите подсохшие листья на фольге или газете.

На рисунках ниже, примеры, получившихся букетов.

Букет из шишек и листьев

Эта красивая и недорогая поделка выглядит очень эффектно. Помимо шишек, все остальные материалы можно найти дома. Некоторые из них можно заменить на свой вкус, например, здесь использовались искусственные листья, вы можете использовать опавшие листья, так будет даже красивее. Или, как вариант, заполнить промежутки между шишками сухоцветами или сухим мхом. Вместо декоративной корзинки, можно взять вазу или даже обычную банку и красиво оформить мешковиной или другим материалом.

Ниже пошаговые фото, как сделать этот прекрасный букет из шишек и листьев своими руками.

На рисунке материалы, которые могут понадобиться для изготовления букета из шишек.

При помощи красок и кисточки шишки нужно преобразить в красивые разноцветные цветы.

Ватной палочкой и желтой краской рисуем серединку нашего цветочка.

Подобным образом поступаем со всеми шишками.

Прикрепляем проволоку к шишкам и втыкаем их в подготовленную пенопластовую основу. Можно также использовать деревянные шпажки или зубочистки и клеевой пистолет.

В итоге красивый букет из природного материала – готов!

Как сделать из еловых шишек цветы циннии

А вам не кажется, что перевернутые сосновые шишки походят на циннии? Давайте изготовим несколько таких соцветий!

Особо сложных действий совершать не нужно – природа уже все сделала за нас!

При помощи плоскогубцев отщипните центральную верхнюю часть и аккуратно приклейте к ней палочку от дерева либо шпажку, которую можно обернуть тейп-лентой или гофрированной бумагой зеленого цвета.

После высыхания клея надо покрасить наши цветы. Для этого воспользуйтесь акриловой краской. Заменить ее можно чем угодно – краской из баллончиков, лаком для ногтей и т. п. Если вы хотите получить яркие оттенки, вначале прокрасьте шишку белой краской – она будет играть роль грунтовки, а уже на нее нанесите цвет.

Не отрезайте центр, если запланирован компактный букетик, выполненный на какой-либо основе (пенопласте или пластилине) – острая часть вам пригодится для фиксации “цветка”.

Вот такие красочные циннии у нас получились! Осталось подобрать вазочку либо корзинку и сформировать букет из шишек – поделку в школу или детский сад.

Роза из шишки

Вам нравится роза – королева цветов? Пусть будут розочки! Такой букет из шишек, поделка в школу – не сможет завянуть!

Конус Translum ™: пошаговое руководство

Все фотографии предоставлены Джеффом Меллоди

Мир профессиональной фотографии полон проблем и препятствий. Каждый раз, когда вы берете в руки камеру, вам приходится преодолевать еще одну проблему. Недавно столкнулся с проблемой, для которой нет готового решения. Иногда больше снаряжения — не выход, просто нужно сделать собственную ловушку, чтобы поймать мышь.

Проблема

Как снимать небольшие объекты при постоянном освещении. Маленькие предметы по самой своей природе требуют деликатного освещения и часто требуют освещения в близких или маленьких отражателях, которые необходимо регулировать для каждого предмета, что делает их внешний вид несовместимым. Мое решение — это проект «сделай сам», который требует немного времени, но в конечном результате принесет большое удовлетворение.

Решение

Легче всего фотографировать небольшие объекты с помощью легкой палатки. Кажется, что свет исходит со всех сторон, отлично подходит для отражающих объектов и не отвлекает неприглядных теней.Но зачем тратить 100 долларов и более на покупку легкой палатки, если с Savage Translum можно сделать что-то еще лучше? У Translum так много применений, что нет причин не хранить рулон.

Припасы

• рулон материала Translum среднего веса
• прямая кромка длиной не менее 24 дюймов
• транспортир
• прозрачная упаковочная лента
• 2 А-образных зажима
• ножницы
• универсальный нож

Инструкции

Следующие инструкции предназначены не для легкой палатки, а для легкой палатки.Это намного проще и можно сделать примерно за 15 минут.

1. Сначала вам нужно отрезать полоску от рулона Translum длиной 22 дюйма и шириной 60 дюймов, так как это ширина рулона. Кромку размером 60 дюймов нужно обрезать прямой кромкой.

Примерно посередине этого края отметьте маленькую точку, от которой будут основываться все измерения.

А теперь урок математики в начальной школе. Вам нужен транспортир. Спорим, ты никогда не думал, что воспользуешься этим снова.

2. Приложите прямой край транспортира к прямому краю Translum и отцентрируйте нулевую отметку над точкой, которую вы сделали на Translum. Найдите 87 градусов. Проведите линию от точки под углом 87 градусов к дальнему краю материала.

3. Теперь мы проведем две изогнутые линии. Один будет иметь радиус 8 1/4 дюйма, а другой — 20 5/16 дюйма. Для пользователей метрической системы это 205 мм на 515 мм. Вы спросите, как рисовать изогнутые линии? Самый простой способ, который я нашел, — это использовать веревку.Используя длинную линейку, я просто зажимаю один конец веревки левой рукой, а другой рукой беру ручку и веревку нужной длины. Поместив левый конец струны в маленькую точку, вы рисуете полукруг от края материала до линии под углом 87 градусов, которая только что была нарисована на Translum. Повторите то же самое для другого полукруга.

4. Затем возьмите ножницы и прорежьте полукруги и с помощью прямого края прорежьте линию под углом 87 градусов.

5.Сборка конуса упрощается с помощью пары А-образных зажимов и гладильной доски. Выровняйте узкий конец и прикрепите А-образный зажим. Проделайте то же самое с другим концом.

6. Проденьте широкий конец над узким концом гладильной доски и дайте ему ровно уложиться.

7. Прикрепите полоску прозрачной упаковочной ленты, чтобы закрепить конус.

8. Снимите А-образные зажимы и обмотайте каждый конец шва лентой, и все готово!

Готовый конус имеет отверстие 4 дюйма сверху, отверстие 10 дюймов снизу и 12 дюймов в высоту.Верхнее отверстие достаточно велико, чтобы вместить большинство макрообъективов с прикрепленной блендой.

Для наиболее равномерного освещения я предлагаю 2 источника света, разнесенных на 180 градусов. Тип освещения не имеет значения. Студийные стробоскопы, вспышки или люминесцентные лампы подойдут. Излучаемый свет очень ровный и отлично подходит для съемки ювелирных украшений. Изготовление светового конуса обошлось мне в материал Translum менее 6,50 долларов.

Руководство по полевым операциям для обеспечения безопасности / служебного патрулирования: временное управление движением в чрезвычайных ситуациях

Временный контроль дорожного движения в зоне управления дорожно-транспортными происшествиями

Использование временных средств контроля дорожного движения (TTC) при управлении дорожными происшествиями Area (TIMA) помогает безопасно и быстро перемещать участников дорожного движения мимо или вокруг инцидента, снижает вероятность вторичных дорожно-транспортных происшествий, и удерживает автомобилистов от окружающих дорог.

TTC включают такие устройства, как дорожные конусы, панели со стрелками и предупреждения знаки, а также использование ручного управления движением (установка флажков).

Вам всегда нужно:

• Используйте безопасные методы для выполнения ваших задач в движении и вблизи движения.
• Будьте осторожны с встречным движением.
• Принять меры по перемещению места происшествия как можно дальше от проезжали по проезжей части, насколько это возможно, или чтобы обеспечить соответствующее предупреждение о заблокированные полосы движения.
• Установите соответствующий временный контроль движения. Запросить дополнительные управление дорожным движением, если инцидент не будет устранен быстро.
• Отправка обновлений в течение 15 минут с момента прибытия при происшествии:
  • Ваша обновленная оценка масштабов дорожно-транспортного происшествия, включая количество и типы транспортных средств, травм и полосу движения закрытия.
  • Ожидаемая продолжительность дорожного происшествия.
  • Ожидаемая длина очереди транспортных средств.
• Регулярно проверяйте устройства TTC — рекомендуется каждые 15 минут. Сделайте небольшой шаг, пусть даже небольшой, для улучшения дорожного движения на месте происшествия. сцены, такие как выпрямление или удлинение конусов, перемещение автомобиль-ответчик или уменьшающее аварийное освещение.

Рис. 7. Управление шоссейных дорог штата Мэриленд, координация Группа реагирования на дорожные ситуации (ДИАГРАММА) Группа аварийного реагирования.

Безопасное размещение автомобиля

Размещение транспортного средства во время первоначального ответа важно для установить безопасный и эффективный контроль движения.

При блокировании полосы движения:

• Разместите автомобиль на видном месте между происшествиями. и приближающийся транспорт. Активируйте панель со стрелками, чтобы предупредить автомобилистов и направьте движение по сцене, пока вы настраиваете закрытие полосы движения конус с транспортными конусами.
• Переместите свой автомобиль по мере необходимости, чтобы лучше использовать панель со стрелками как только дорожные конусы установлены.
• Подумайте о том, чтобы изменить положение вашего автомобиля, чтобы оставить больше места для чрезвычайных ситуаций транспортных средств по мере поступления дополнительных ресурсов.
• Общайтесь с другими агентствами на месте происшествия, когда это уместно, через структура управления инцидентами, чтобы гарантировать, что размещение аварийного автомобиля оптимизирован для безопасности сцены, операций на месте и транспортного потока мимо сцены.Рассмотрите возможность размещения дополнительных машин реагирования за пределами площадки пока не понадобится.
• Продолжайте искать возможности для улучшения транспортного потока и безопасность сцены.

Использование аварийного освещения

Надлежащее использование аварийных фонарей высокой интенсивности, вращающихся, мигающих, или стробоскопы — обязательно.

Аварийное освещение наиболее эффективно, когда дорожное происшествие блокирует полосы движения и устройства управления движением еще не развернуты.Один раз аварийно-спасательные службы развертывают временное управление движением, аварийное освещение следует уменьшить. Аварийное освещение не обеспечивает движение транспорта контроль и не считается устройством управления трафиком.

Избыточное или неверно направленное освещение может создать путаницу при приближении. участников дорожного движения и увеличивают вероятность вторичных аварий. Автомобилисты приближение к дорожно-транспортному происшествию с противоположной стороны на разделенном объекты часто отвлекаются на освещение аварийных автомобилей и медленные вниз, иногда резко, чтобы посмотреть на проезжающие мимо дорожные происшествия, представлять опасность для себя и других путешественников.Затяжной эффект этого отвлечения способствует увеличению заложенности носа и в результате задерживать.

• Свести к минимуму использование аварийных огней автомобилями с множественным реагированием по мере установления каналов и заблаговременного предупреждения.
• Контролировать и регулировать аварийное освещение во время инцидента для улучшения видимость устройств управления дорожным движением и сокращение задержки наблюдателей.
• Используйте панели со стрелками вместо мигающих огней для обеспечения движения контроль.
• Используйте аварийное освещение — в соответствии с действующим законодательством и действующим законодательством. процедуры-когда:
  • На пути к подтвержденному инциденту с травмами или блокировкой проездной.
  • Использование приспособлений, например аварийных кроссоверов или плечевого пояса уполномочен делать это, на что общественность не уполномочена водить.
  • Помощь автомобилистам, оказавшимся в затруднительном положении, правоохранительным органам или другим лицам в опасном месте.
  • Захват полосы движения или любой части полосы движения во время происшествия когда панель со стрелками не работает.
  • Повторный выезд на полосу движения со стоянки на плечо. Включите аварийные огни, обращенные назад, пока не дойдете до места движения. скорость.
• НЕ используйте аварийное освещение в следующих случаях:
  • На пути к неэкстренному происшествию, например к остановке транспортного средства на плече.
  • На пути к неподтвержденному инциденту.

Использование панели со стрелками

Машина S / SP со стрелкой, вероятно, самая эффективная имеется временное устройство контроля дорожного движения. Правильное использование установленного на транспортном средстве панель со стрелками или динамический информационный знак (DMS), если таковой имеется, необходимы для аварийного временного управления движением на месте происшествия.

Панель со стрелками, используемая в сочетании с дорожными конусами и другими устройства управления движением, обеспечивает точное наведение на прямое приближение движение вдали от заблокированной полосы движения на месте происшествия.

• Используйте панель со стрелками в режиме стрелок только для обозначения заблокированного движения переулок.

Рисунок 8. Панель со стрелками, указывающая на заблокированную полосу.

• Используйте панель со стрелками в режиме «Осторожно», когда находитесь на плече или рядом с ним проезжей части.

Рисунок 9. Панель со стрелками, указывающая на предупреждение.

• Не превышайте рекомендованную производителем скорость, которая обычно 40 миль / ч, со стрелкой в ​​вертикальном положении. Ущерб от ветра к панели, крепления и / или транспортное средство могут стать причиной.
• Следите за общей высотой вашего автомобиля с помощью панели со стрелками. как в опущенном, так и в вертикальном положении.

Размещение дорожного конуса

Операторы

S / SP должны быть экспертами в настройке краткосрочного контроля трафика чтобы сделать сцены происшествий более безопасными.Конусы служат защитными приспособлениями а также эффективные устройства управления дорожным движением.

Размещение конуса движения при блокировании полосы движения

• Носите на своем автомобиле не менее 16 конусов.
• Установить конусы в виде конуса для направления приближающегося транспорта. в доступные полосы движения, чтобы безопасно обойти место происшествия.
• Начните развертывание конусов в задней части автомобиля и работайте над путь вверх по течению.
• Усиление и выпрямление линий дорожных конусов и конусов после их начальное размещение для повышения эффективности и максимальной видимости конусов.
• Не забывайте всегда стоять лицом к лицу при установке или удалении конусов.
• Разместите конусы на расстоянии не менее 20 футов друг от друга.
• Используйте 12 конусов для конуса закрытия полосы движения, что должно быть примерно 250 футов и четыре конуса вдоль зоны активности, чтобы быстро сделать сцена безопаснее.
• Поместите конусы вокруг транспортных средств реагирования и поместите хотя бы один конус. вниз по течению мимо места происшествия, чтобы освободить место для парковки машины скорой помощи или автомобиль EMS.
• Используйте отметки в виде полос в качестве ориентира расстояния, чтобы облегчить размещение конуса. Разметка проезжей части на автострадах обычно имеет нарисованную полосу шириной 10 футов. и промежуток в 30 футов.
• Увеличьте количество конусов и расстояние между конусами как скорость приближающегося транспорта увеличивается.Это дает автомобилистам больше времени, чтобы среагировать, замедлиться и слиться.
• Очерченные конусы движения с чистыми отражающими конусами.
• При работе в ночное время используйте только рефлекторные конусы.
• Заимствовать дополнительные конусы у других отвечающих подразделений или запросить некоторые из другого подразделения S / SP через отправку, если это необходимо.
• Улучшите транспортный поток, переместив переходной конус дальше вверх по потоку из зоны деятельности, поскольку устанавливаются дополнительные средства регулирования дорожного движения место.

Рисунок 10. Пример временного аварийного управления трафиком.

Положительный контроль трафика

Обеспечение ручного положительного контроля трафика, также называемого флагом, на место происшествия снижает нагрузку на автомобиль и помогает поддерживать движение транспорта плавно миновал сцену.

• По возможности поручите квалифицированным флагманам ручное управление движением, но любой персонал реагирования может предоставить это при необходимости.
• Не использовать посторонних, добрых самаритян или другой необученный персонал. для управления движением.
• Давать команды или направления движения ясно, вежливо, но твердый тон.
• Сопровождать словесные команды «стоп», «замедлить» и «продолжить». с соответствующими движениями рук или с использованием ракетки «Стоп / Медленно» или флаг.
• Обратите внимание, что свистки также могут быть эффективным инструментом.
• Расположитесь в безопасном месте рядом с разбитыми автомобилями. при обеспечении положительного контроля движения в зоне деятельности.
• Расположитесь в безопасном месте недалеко от начала конусность при обеспечении положительного контроля движения в переходном конусе область.
• Установите зрительный контакт с водителями приближающихся транспортных средств, чтобы поощрить чтобы они обращали внимание на свое вождение, а не на происшествие.Этот увеличит поток транспорта мимо места происшествия, уменьшив задерживать.
• Избегайте предоставления автомобилистам индивидуализированных указаний, так как это может создать больше заторов из-за замедления движения. Помни, твоя работа должен поддерживать движение транспорта.

Рисунок 11. Команды-флажки для аварийного положительного управления трафиком.

Предварительное предупреждение и защита очереди

Когда происходит инцидент, существует значительная вероятность вторичного инцидент, который часто бывает более серьезным, чем исходное событие.S / SP операторы играют важную роль в сокращении этих вторичных инцидентов.

Транспортные средства, приближающиеся на высокой скорости, часто сталкиваются с остановившимися очередь движения задолго до стрелочных панелей и аварийного освещения сцены видны. Этот высокоскоростной трафик не предполагает остановленного трафика. и нуждается в соответствующем предупреждении.

Специальные предупредительные знаки для управления инцидентами, размещенные вами или другие респонденты предупреждают приближающихся автомобилистов.Эти знаки могут быть особого флуоресцентного розового цвета с такими надписями, как «АВАРИЙ ВПЕРЕДИ» и «БУДЬТЕ ГОТОВЫ К ОСТАНОВКУ».

Координировать действия с отвечающими подразделениями, которые либо уже находятся на месте происшествия. или прибывают на место происшествия, чтобы поставить предупредительные знаки.

• Сдвиньте назад и поместите предупреждающие знаки сразу после того, как сцена безопасна, если вы являетесь первым отвечающим и дополнительным единицы недоступны для оказания помощи.
• Разместите знаки заблаговременно перед очередью. Переместите их, если нужный.
• Действовать как «глаза и уши» TMC, если он работает в области. Поддерживайте постоянную связь с TMC, пока на месте происшествия, чтобы устройства предупреждения о дорожном движении, такие как DMS может быть обновлен с точной информацией для приближающихся автомобилистов.
• Получить дополнительные знаки, если необходимо, от других подразделений реагирования. и разместите их по обеим сторонам проезжей части задолго до сцена.

Рис. 12. Предупреждающие знаки о происшествии.

Демонтаж места происшествия

Помогите при завершении инцидента обеспечить безопасное удаление всех компонентов сцены инцидента. Работайте с другими респондентами разработать план разбивки сцены, чтобы безопасно удалить все оставшиеся респонденты, транспортные средства-ответчики и устройства TTC.

• Удалите весь мусор с проезжей части и обочины.
• Удалите устройства управления трафиком в восходящем направлении. Начинать в зоне завершения и продвигайтесь к заблаговременному предупреждению область.
• Сделать уведомление диспетчеру, когда полосы будут вновь открыты.
• Будьте начеку для нетерпеливых автомобилистов. С жертвами инцидента и транспортные средства удалены, задержанные водители не будут так осторожны и могут не видеть тебя.

Очистка внешнего сегмента колбочки для протеомного анализа его мембранных белков сетчатки карпа

Рис 2.

Количественная оценка зрительных пигментов.

Количество зрительных пигментов измеряли спектрофотометрически в трех типах препаратов палочки (А) и конуса (В): мембраны из очищенных клеток в качестве исходных материалов (исходные), мембраны в верхней (верхняя фракция) и нижней (нижняя фракция) фракциях. .(A) Содержание родопсина измеряли в мембранах исходного стержня (левые панели), в верхней и нижней фракциях (средняя и правая панели, соответственно), все полученные из одинакового количества клеток и суспендированные в одном и том же объеме раствора Рингера. На каждой из верхних панелей кривая 1 (черная) показывает спектр поглощения до отбеливания, а кривая 2 (синяя) показывает спектр после полного отбеливания родопсина при освещении светом> 440 нм. Кривая 2 была вычтена из кривой 1 на каждой из верхней панели, чтобы получить разностный спектр, который показан на соответствующей нижней панели.По положительному поглощению родопсином (λ _max = 522 нм) определяли относительное содержание родопсина. (B) Содержание чувствительных к красному, зеленому и синему пигментов было измерено в исходных очищенных конических мембранах (левые панели), в верхней и нижней фракциях ((средняя и правая панели, соответственно). В каждой из верхних панелей , кривая 1 (черная) показывает спектр поглощения до отбеливания.Чувствительный к красному пигмент сначала отбеливали светом> 675 нм (кривая 2), а затем чувствительный к зеленому пигмент светом> 600 нм (кривая 3) и, наконец, пигмент, чувствительный к синему. со светом> 440 нм (кривая 4).Кривая 2 вычиталась из кривой 1, чтобы получить разностный спектр чувствительного к красному цвету пигмента, который показан на соответствующей нижней панели (красная кривая 1 ‘, λ _max = 622 нм). Аналогичным образом были получены разностные спектры для чувствительного к зеленому пигмента (зеленая кривая 2 ‘, т. Е. Кривая 2 — кривая 3; λ _max = 535 нм) и для чувствительного к синему пигмента (синяя кривая 3′, т. Е. Кривая 3 — кривая 4; λ _max = 460 нм) для определения относительного содержания этих пигментов.

Подробнее »

ZFIN Все рисунки, Salbreux et al., 2012

Рис. S4 Дифференциация фоторецепторов колбочек и проработка апикального отростка. A) Криосрез сетчатки личиночных трансгенных рыб ( mi2009 ) через 4 дня после оплодотворения (dpf), в котором синие и УФ-конусы экспрессируют репортеры mCherry и EGFP (псевдоцветные синие и пурпурные соответственно), которые заполняют цитоплазму клетки. OLM (стрелка) помечен иммуноокрашиванием ZO-1 (желтый). Развивающиеся внутренний и внешний сегменты колбочек апикально выступают за OLM. B) Личинка mi2009 рыб с 4 dpf, иммуно меченная Crb2a (желтый). Обратите внимание, что белок Crb2a выходит за пределы OLM (стрелка) на плазматической мембране внутренних сегментов.C) На 10 dpf внутренний и внешний сегменты конуса удлиняются еще больше, а белок Crb2a также распространяется дальше апикально на внутренних сегментах. Стрелка указывает уровень OLM. D) Изображение с помощью дифференциального интерференционного контраста (ДИК) криосреза сетчатки взрослой рыбки данио, иммуномеченного ZO-1 (желтый) для маркировки OLM (стрелка). Внутренний и внешний сегменты колбочек отходят на вершину; УФ-конусы самые короткие, синие (B) конусы длиннее, а красные и зеленые (RG) двойные конусы самые длинные.E) ДИК-изображение с иммунолокализацией белка Crb2a на внутренних сегментах колбочек. Черная стрелка указывает на OLM. На вставке показан белок Crb2a на границе между красными и зелеными двойными конусами (белые стрелки). F) То же изображение, что и на панели E, без канала DIC. G) Изображение с помощью дифференциального интерференционного контраста (DIC) криосреза сетчатки взрослого трансгенного данио ( mi2002 ), экспрессирующего флуоресцентный репортер в глии Мюллера (голубой) и иммуно меченного Crb2a (желтый).H) То же изображение, что и на панели E, без канала DIC. Отростки мюллеровой глии (белые стрелки) апикально выходят за пределы OLM, но не до Crb2a (желтые). Отростки Мюллера не разделяют границу раздела между внутренними сегментами пар двойных конусов красного и зеленого цветов, которые имеют сильное окрашивание на Crb2a (желтые стрелки). I) Левая половина: ДИК-изображение криосреза сетчатки взрослой трансгенной рыбки данио ( mi2002 ), экспрессирующего флуоресцентный репортер в глии Мюллера (голубой) и иммуноокрашенного zpr1 , который маркирует красные и зеленые колбочки (пурпурный).Правая половина: то же изображение без канала DIC. Отростки глии Мюллера (белая стрелка) не расположены между внутренними сегментами пар двойных конусов красного и зеленого цветов (пурпурная стрелка). J – L) Отдельные оптические срезы из конфокального изображения z-стека, иммуномеченного Crb2a, рядом с краем сетчатки в плоском держателе сетчатки (обрезанная версия из той же серии изображений, показанной на рисунке 6A). Панель J находится на уровне OLM, панель K — это субапикальная область (SAR) на расстоянии 2,5 мкм от OLM, а панель L — это SAR на расстоянии 5 мкм от OLM.Идентичность подтипов фоторецепторов колбочек обозначена звездочками: красный, зеленый, синий и УФ (пурпурный) соответственно. В SAR Crb2a имеет плоское поляризованное распределение — оно выражается на более высоких уровнях на границах раздела красного, зеленого и синего конусов внутри столбца. Поверхность сетчатки изогнута, поэтому левая и правая стороны каждой панели расположены более апикально, чем центр (и, таким образом, показывают несколько более поляризованное распределение Crb2a в J и K).

Границы | Обнаружение света, не образующего изображения, с помощью меланопсина, родопсина и длинно-средневолнового (L / W) конического опсина у подземной слепой кротовой крысы, Spalax Ehrenbergi: иммуногистохимическая характеристика, распределение и связь

Введение

Слепыш Spalax ehrenbergi (семейство муроидов Spalacidae) — слепое подземное млекопитающее с рудиментарными глазами, расположенными под кожей.Будучи полностью слепым (Cernuda-Cernuda et al., 2002), Spalax реагирует на световую стимуляцию и способен адаптировать поведение и физиологию к 24-часовому солнечному циклу, а также к сезонным изменениям (David-Gray et al., 1998). ; Нево и др., 2001). Несмотря на то, что эмбриональное развитие кажется нормальным, взрослый глаз Spalax имеет дегенеративную переднюю камеру, радужно-ресничный комплекс и хрусталик, в то время как сетчатка сохраняет свою морфологическую целостность с хорошо организованными слоями, но менее организованными, чем у зрячих млекопитающих ( Cernuda-Cernuda et al., 2002). Глаза имеют диаметр <1 мм, а регрессированный зрительный нерв содержит <900 аксонов. Функциональные исследования подтвердили, что Spalax не обладает зрением, формирующим изображение (Cooper et al., 1993a), и было высказано предположение, что глаз Spalax функционирует как люксметр, соответствующий обнаруженной системе, не формирующей изображения (NIF). в зрячем глазу (Cooper et al., 1993b; Hannibal et al., 2002b). Это мнение подтверждается отслеживанием тракта сетчатки, показывающим, что мозг, участвующий в основном в зрительном восприятии, получает заметно уменьшенные проекции сетчатки, в то время как области, участвующие в функциях NIF (циркадный ритм), такие как супрахиазматическое ядро ​​(SCN) и вентрально-коленчатое ядро ​​(VGL), иннервируются аналогичным образом к зрячим животным (Bronchti et al., 1991; Купер и др., 1993b). В течение последнего десятилетия понимание системы NIF зрячего глаза заметно расширилось за счет анатомических и функциональных наблюдений. Главным открытием была идентификация фотопигмента меланопсина, обнаруженного в субнаборе внутренне светочувствительных ганглиозных клеток сетчатки (ipRGC) (Hattar et al., 2002; Hannibal et al., 2002a). Первоначальные исследования показали, что свет через ipRGC захватывает циркадный ритм независимо от палочек и колбочек (Hattar et al., 2003). Однако стало ясно, что меланопсин, экспрессирующий RGCs (mRGC), в дополнение к входу от палочек и колбочек регулирует циркадный ритм. Кроме того, несколько подтипов мРГК (у мышей M1-M5), соединенных проволокой из палочек и колбочек, способствовали легкому захвату циркадной системы (Hattar et al., 2003; Lucas et al., 2003; Schmidt and Kofuji, 2010; Schmidt et al., др., 2011а). Эти наблюдения показали, что система, не формирующая изображения в зрячих глазах, была более сложной, чем предполагалось ранее (Schmidt et al., 2011а; Джаганнатх и др., 2015). В свете этого стало интересно повторно исследовать сетчатку Spalax , которая, несмотря на меланопсин (Hannibal et al., 2002b), как было показано, экспрессирует функциональный родопсин и колбочку длинной / средней волны (L / M). опсин (Janssen et al., 2000, 2003). Более подробное анатомическое понимание сетчатки глаза Spalax может предоставить информацию о сложности системы NIF у этого животного, а также может быть использовано для понимания системы NIF зрячего глаза.

Настоящее исследование обеспечивает с использованием иммуногистохимии и маркеров сетчатки для мРГК, палочек, колбочек, амакринов и биполярных клеток в сочетании с синаптическими маркерами подробное исследование ганглиозных клеток сетчатки, несущих меланопсин, и их синаптических контактов с другими клетками сетчатки.

Материалы и методы

Животные

Шесть слепых слепышей-самцов, Spalax Judaei , принадлежащих к надвиду Spalax Ehrenbergi (Nevo et al., 2001) из популяции анза в Самарии, которых содержали в цикле свет / темнота 12:12 ч. Всех животных анестезировали трибромэтанолом (250 мг / кг, внутрибрюшинно) и проводили транскардиальную перфузию фиксатором Стефанини (2% параформальдегид, 0,2% пикриновая кислота в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,2). Глаза, расположенные в железе Хардера, удаляли, затем фиксировали в течение ночи в том же фиксирующем растворе, подвергали криопротекции в 30% сахарозе и хранили при –20 ° C до иммуногистохимической обработки.Эксперименты проводились в соответствии с этическими принципами ухода за лабораторными животными (Закон об экспериментах на животных в Дании, публикация 1306, 23 ноября 2007 г.) и Dyreforsoegstilsynet, Министерство юстиции Дании. Все животные были убиты между Zeitgeber (ZT) 4-8 (ZT0 = свет включен).

Антитела и иммуногистохимия

Все антитела, использованные в исследовании, перечислены в таблицах 1, 2. С-концевые кроличьи поликлональные антитела против меланопсина (код 41k9, разведенные 1: 5000), охарактеризованные ранее (Hannibal et al., 2002a) использовался для окрашивания всех меланопсинов.

Таблица 1. Первичные антитела .

Таблица 2. Вторичные антитела .

Антитело против меланопсина использовали в комбинации с рядом других антител (таблица 1). Чтобы идентифицировать тела клеток сетчатки, мы установили срезы в глицерине / воде с добавлением ДНК-связывающего AT-специфического флуорохром 4′-6-диамино-2-фенилиндола (DAPI).

Используемые вторичные антитела представлены в таблице 2.В случаях, когда два первичных антитела были продуцированы у одного и того же вида, мы использовали комбинацию биотинилированного тирамида (амплификация тирамидной системы; DuPon NEN, Бостон, Массачусетс) и конъюгированных со стрептавидином красителей AlexaFluor или Envision (Dako, ChemMate, Glostrup, Дания) и красители Alexa, конъюгированные с тирамидом (таблица 2).

Для срезов сетчатки, глазных яблок, залитых тканью Tissue-Tek ^® O.C.T. (Sakura Finetek INC, США) были разрезаны на срезы толщиной 12 мкм последовательно по три в криостате. Срезы помещали на предметные стекла Superfrost, сушили и замораживали при –20 ° C до обработки для иммуногистохимии (IHC).Некоторые срезы предварительно обрабатывали раствором для поиска антигена в течение 24 часов при 40 ° C (Dako ChemMate, Glostrup, Дания; код № S 203120 в дистиллированной воде, pH 6) перед обработкой для ИГХ. Одну сетчатку с плоским креплением получали из одного животного путем удаления роговицы и хрусталика, сетчатку отделяли от сосудистой оболочки и обрабатывали раствором для поиска антигена в течение 1,5 ч при 80 ° C (Dako ChemMate, Glostrup, Дания; код No. S 203120 в дистиллированной воде, pH 6).

Иммуногистохимия выполнялась, как подробно описано ранее, с некоторыми небольшими модификациями (Hannibal et al., 2014). Срезы и плоские сетчатки инкубировали в 5% нормальной ослиной сыворотке в течение 20 минут, чтобы избежать неспецифического окрашивания. Двойные или тройные иммуноокрашенные срезы инкубировали в течение ночи, в то время как плоское крепление инкубировали в течение 3 дней при 4 ° C. Срезы промывали и инкубировали со вторичными антителами в течение 60 мин при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C, в то время как плоское крепление инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Контрольные эксперименты выполняли путем предварительной абсорбции первичных антител с их соответствующим антигеном или путем удаления первичного антитела, которое устраняло все специфические окрашивания.

Микрофотография, подсчет клеток и морфологический анализ

Изображения были получены с использованием конфокального микроскопа iMIC (Till Photonics, FEI, Германия), оснащенного соответствующими настройками фильтров для обнаружения DAPI, CY2 / Alexa488, Texas Red / Alexa561 / 594 и CY5 / Alexa647. IMIC был оснащен следующими объективами: X20, числовая апертура (NA) = 0,75; X40, NA = 1,3 и X60, NA = 1,46. Используя X60, самое высокое разрешение [( r = λ / NA), где λ — длина волны изображения] было для X60 = 174 нм.Разрешение по оси Z составляло X60 0,2 мкм. Все изображения в z-стеках были сфотографированы с использованием объектива X40 или X60, и все были деконволютированы в AutoQuantX, версия 3.04 (Media Cybernetics, Inc., Роквилл, США), а затем проанализированы в IMARIS ^® вер. 7.6 и 8.1 от Bitplane, Швейцария (http://www.bitplane.com). Для определения совместной локализации двух маркеров на трехмерных изображениях использовался модуль совместной локализации в IMARIS ^® . Определение совместной локализации между меланопсином и RBPMS в одной клетке (2D) было выполнено с помощью подключаемого модуля совместной локализации в программном обеспечении ImageJ / Fiji (версия.1.47q, NIH, USA), в котором точки двух 8-битных изображений с обоими антигенами оказались белыми (мы использовали значение по умолчанию = 255). Считалось, что пиксели отражают совместную локализацию антигенов, если их интенсивности были выше, чем порог соответствующих каналов (мы используем порог, установленный на уровне 50-100 в зависимости от фонового шума), и если отношение их интенсивности было выше, чем отношение значение настройки (мы использовали значение по умолчанию, равное 50%).

Меланопсин и РНК-связывающий белок с множественным сплайсингом (RBPMS) подсчет клеток проводился на каждом третьем срезе последовательной серии срезов одного глаза от двух животных, которые были сфотографированы с помощью конфокального микроскопа iMIC с использованием объектива X20, создавая Z-стеки, покрывающие толщина (12 микрон, каждое сечение = 1 микрон) (Рисунки 1D – F).Каждый z-стек, взятый из сетчатки, был сшит вместе с использованием плагина LA Stitch в программном обеспечении Fiji (версия 1.47q, NIH, США) для создания изображения всей сетчатки. Затем каждое из этих изображений было проанализировано, как описано выше. У одного животного плотность клеток меланопсина / RBPMS также была подсчитана в срезах, разрезанных по горизонтали через большую площадь слоя ганглиозных клеток (GCL) (рисунки 1G – I), и плотность сравнивалась с плотностью клеток меланопсина, полученными из срезов и рассчитанное общее количество клеток (см. ниже).Сетчатка с плоским креплением была сделана микрофотография в IMIC, а трехмерная реконструкция Z-стопок (ось Z = 40 микрон) была создана и проанализирована в IMARIS ^® (после сшивания всех Z-стопок вместе с использованием плагина LA Stitch в Программное обеспечение Фиджи (версия 1.47q, NIH, США)). Скорее всего, из-за сильного прикрепления GCL и дегенерированного хрусталика большая часть GCL была потеряна. Однако информация о плотности смещенных RGC меланопсина и дендритной сети меланопсина в IPL и OPL была подтверждена и расширила наблюдения из срезов сетчатки, и можно было оценить плотность смещенных RGC меланопсина (см. Ниже и см. Рисунок 2).Чтобы измерить дендритные области отдельных mRGC, мы проследили минимальный выпуклый многоугольник, охватывающий дендритное поле, на трехмерных изображениях каждой помеченной клетки и измерили каждый дендритный профиль с помощью программного обеспечения Fiji. Подтипы RGC, экспрессирующие меланопсин, были исследованы и сравнены с подтипами, ранее определенными для сетчатки мыши (Schmidt et al., 2011a; Cui et al., 2015), а смещенные клетки меланопсина были подсчитаны с использованием модуля подсчета клеток 3D на Фиджи. Общее количество клеток меланопсина и RBPMS было представлено с поправкой Аберкромби (1946) и без нее (Guillery, 2002).Для поправочного коэффициента мы умножили количество отсчетов в каждой секции на T / T + h, где T — толщина секции (12 мкм), а h — средняя высота диаметра ядра. Все изображения были скорректированы по яркости и контрастности либо в Фиджи, либо в Photoshop CS5 (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния) и установлены на пластины в Adobe Illustrator CS5 (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния).

Рис. 1. Конфокальные микрофотографии RGC (mRGC) меланопсина (зеленый) и ядерного контрастного окрашивания DAPI (красный) в Spalax сетчатке (A – C) .RGC меланопсина были локализованы в слое ганглиозных клеток (GCL), и несколько смещенных RGC были обнаружены во внутреннем слое ядерных клеток (INL) (указано стрелкой). mRGCs проецируются в основном в IPL, но также и во внешний плексиформный слой (OPL) (на примере открытой стрелки), где они формируют внешнее сплетение (указано одиночными стрелками в A – C ). Немногочисленные процессы наблюдались также во внешнем ядерном слое (ONL) (обозначены двойными стрелками в A, B ). (D – I) Маркер ганглиозных клеток RBPMS (красный) в сочетании с меланопсином (зеленый) и ядерным контрастным окрашиванием DAPI (синий) в сагиттальных срезах (D – F) и горизонтальных срезах через GCL (G – I) .Масштабные линейки: (A) ; 40 мкм, (B, C) ; 15 мкм, (D – F) ; 100 мкм, (G – I) ; 50 мкм.

Рисунок 2. Дендритное ветвление mRGC ​​в сетчатке Spalax . (A) Репрезентативное изображение области сетчатки спалакс целиком было реконструировано в 3D после мечения антителом против меланопсина. (B) Репрезентативные рисунки дендритного поля и сомы mRGC ​​из изображения трехмерной реконструкции в (A) . (C) Минимальные многоугольники, расположенные вокруг дендритного профиля каждого реконструированного mRGC ​​в (B) . Обратите внимание на сложность дендритного сплетения mRGC. Масштабная линейка: 100 мкм.

Результаты

RGC меланопсина расслаиваются как во внутреннем, так и во внешнем плексиформных слоях

Вертикальные срезы глаза Spalax продемонстрировали, что сетчатка глаза Spalax содержит фоторецепторный слой (ONL), внешний плексиформный слой (OPL), внутренний ядерный слой (INL), внутренний плексиформный слой (IPL) и слой ганглиозных клеток ( GCL).Эти слои были менее организованы, чем у зрячих млекопитающих (рис. 1А), и были обнаружены примеры клеток, смещенных из своей локализации в видимой сетчатке почти всех проверенных типов клеток (см. Ниже).

Примерно 95% всех клеток меланопсина были локализованы в GCL, и эти мРГК проецировались в основном в IPL, хотя дендритные отростки были обнаружены во всех подслоях IPL, формируя сложное дендритное поле (Рисунки 1A, 2). Почти все mRGCs в GCL посылают дендриты в OPL, формируя внешнее сплетение (Figures 1A-C).Самая высокая плотность дендритов была обнаружена вблизи INL, как в зрячих сетчатках (Рисунки 1A – C, 3). Клетки меланопсина, расположенные в INL, проецируются либо на IPL, либо во внешнее сплетение в OPL (Рисунки 1B, C, 3C). Некоторые меланопсиновые отростки также были обнаружены в ONL (Рисунки 1A – C). Несмотря на локализацию, не было обнаружено очевидных различий между mRGC ​​в отношении размера сомы, ветвления или морфологии дендритов, хотя плотность клеток в GCL затрудняет четкое различение профиля дендритов (Рисунки 1G, 3A).Тело клетки обычно имело диаметр 12,2 ± 0,4 мкм и дендритное поле 0,072 ± 0,006 мм ² с 3-4 главными дендритными ветвями (Фигуры 2, 3B).

Рисунок 3. Меланопсин (зеленый) RGC (mRGC) и ядерное контрастное окрашивание DAPI (красный) в плоском корпусе Spalax retina . XYZ-изображения слоя ганглиозных клеток (GCL) (A) , внутреннего плексиформного / внутреннего слоя ядерных клеток (IPL / INL) (B) и внешнего плексиформного слоя (OPL) (C) , показывающие иммунореактивность меланопсина в незначительный остаток GCL (стрелки в A ) и смещенный mRGC ​​в INL (стрелка в B ) и меланопсиновое сплетение в OPL в (C) (указано стрелками).Обратите внимание на проекции X-Z и Y-Z, показывающие разные подслои. Масштабные линейки: (A – C) ; 30 мкм.

Меланопсин экспрессируется почти в 90% всех RGC

Используя маркер ганглиозных клеток RBPMS (Rodriguez et al., 2014) в сочетании с меланопсином, мы обнаружили, что общее количество мРГК от двух животных составляет 890 ± 62 клеток на сетчатку. Из них 87% (752 ± 40) содержат меланопсин (плотность клеток меланопсина 788 RGC / мм ² ). Мы также подсчитали RBPMS и меланопсин-положительные клетки в горизонтальном срезе GCL (Рисунки 1G – I) с площадью 0.077 мм ² . Используя этот препарат, мы обнаружили в общей сложности 115 клеток, содержащих RBPMS. Из них 73 RGC совместно хранят меланопсин, что соответствует плотности клеток RGC меланопсина 949 клеток / мм ² , что выше, но согласуется с количеством клеток, полученным на срезах сетчатки. Однако популяция немеланопсиновых RBPMS-положительных клеток была немного выше в этом участке сетчатки, что дает общую оценку RGC в Spalax , составляющую 1495 RGC / мм ² .В целом подсчет клеток RBPMS и меланопсина варьировался в зависимости от используемых методов и ткани, но, по-видимому, согласуется с количеством RGC, обнаруженным (Cooper et al., 1993a). Он обнаружил ~ 900 RGC в сетчатке Spalax , идентифицированных с помощью ретроградного отслеживания тракта от обнаженного зрительного нерва (Cooper et al., 1993a). Подсчет клеток, произведенный путем подсчета RGC в каждой третьей секции двух глаз, мог привести к «завышенному подсчету» (см. Guillery, 2002). Поэтому мы также скорректировали количество клеток, используя поправку Аберкромби (Guillery, 2002), используя средний диаметр ядра, как описано недавно (La Morgia et al., 2015). Используя рассчитанный поправочный коэффициент Аберкромби [ T / T + h , где T = 12 мкм, ядерное среднее ( h ) = 8,69 мкм] 0,57, общее количество RGC уменьшилось до 507 RGC / сетчатка. Для сравнения, количество ячеек в секции через GCL «Flatmount» было меньше и может быть занижено поправкой.

Мы также подсчитали смещенные клетки меланопсина в сетчатке с одним плоским держателем и обнаружили 19 клеток / 0,49 мм ² .Если размер сетчатки составляет ~ 1,3 мм ² (Cooper et al., 1993a), это соответствует ~ 50 смещенным меланопсиновым клеткам во всей сетчатке Spalax . Это дает соотношение ~ 5% от общего числа mRGC, смещенных в INL. Как сообщалось ранее (Hannibal et al., 2002b), мы обнаружили PACAP во всех меланопсинах, экспрессирующих RGCs, и в дендритах, локализованных как в IPL, так и в OPL, и в нескольких отростках меланопсина в ONL (Figures 4A-F).

Рисунок 4. Репрезентативный срез сетчатки PACAP (красный) и меланопсина (зеленый), коэкспрессируемый в mRGC ​​(A – C) .Обратите внимание, что PACAP и меланопсин были обнаружены в RGC (обозначены тонкими стрелками в B, C ) и в дистальных дендритах во внутреннем ядерном слое (INL) и внешнем плексиформном позже (OPL) (обозначены двойными стрелками в A – C). ). Кальретинин (красный) был обнаружен в субпопуляции немеланопсиновых RGC и в амакриновых клетках в INL. Brn3a (синий) был обнаружен во всех немеланопсиновых RGC, совместно хранящих кальретинин (D – F) (ядерное контрастное окрашивание с DAPI серым цветом в D ).На панели (E) показана рамка, указанная в (D) , зрительного нерва, содержащего меланопсин и кальретинин-положительные аксоны. Панель (F) Показывает Brn3a в не-mRGC при большом увеличении. Масштабные линейки: (A – C) ; 30 мкм, (D) ; 50 мкм, (E, F) ; 15 мкм. GCL; слой ганглиозных клеток, IPL; внутренний плексиформный слой, INL; внутренний ядерный слой.

Немеланопсиновые RGC экспрессируют Brn3a и кальретинин

Мы исследовали, можно ли классифицировать оставшиеся немеланопсиновые RGC по известным маркерам ганглиозных клеток (Lee et al., 2010; Jain et al., 2012; Надаль-Николас и др., 2012). Мы обнаружили, что все немеланопсиновые RGC (138 ± 22) потребляли Brn3a и кальретинин (Рисунки 4D-F). В то время как Brn3a имел ядерную локализацию, кальретинин был обнаружен в цитоплазме и в отростках нейронов, включая аксоны. В срезах, на которых зрительный нерв выходит из глаза, могут быть продемонстрированы аксоны, содержащие меланопсин и кальретинин (Рисунки 4D, E).

Дендриты меланопсина обнаружены в тесном сопоставлении с ножками стержней и колбочек, что указывает на синаптические контакты

Было показано, что сетчатка Spalax богата экспрессирующими родопсин клетками, расположенными в ONL, но также и во INL (Janssen et al., 2000). Напротив, только функциональные исследования показали наличие длинноволновых чувствительных клеток, несущих фоторецепторы, в сетчатке Spalax (David-Gray et al., 1999; Janssen et al., 2003). Мы обнаружили сильное мечение родопсином в клетках ONL (Фигуры 5A, D). Наиболее интенсивное окрашивание было локализовано в дегенерированном наружном сегменте, но окрашивание также было обнаружено в мембране сомы фоторецепторных клеток (Фигуры 5A, D, E, 6). Иммунореактивные клетки к родопсину также были обнаружены в INL, что, по-видимому, находится в смещенных фоторецепторных клетках (Рисунки 5, 6).Иммунореактивность к опсину колбочек L / M была продемонстрирована в другой популяции фоторецепторных клеток, преимущественно расположенных в ONL, но также и в нескольких смещенных клетках в INL (Фигуры 5A, C, E, 6A, C, D). По сравнению с клетками родопсина количество клеток, экспрессирующих опсин колбочек L / M, было меньше как в ONL, так и в INL (Фигуры 5, 6). Клетки фоторецепторов опсина колбочек L / M показали наиболее интенсивную иммунореактивность во внешнем сегменте (фиг. 6C, D), но L / M-опсин также был замечен в клеточной мембране сомы и во внутреннем сегменте (фиг. 6D).L / M-позитивные по опсину клетки колбочек, расположенные в INL, по-видимому, лишены внешнего сегмента и проецируются в IPL или GCL (Фигуры 5C, E, 6A). Все меланопсинсодержащие дендриты, проникающие в OPL, были обнаружены в тесной оппозиции как стержневым, так и коническим ножкам (Рисунки 6B-D, 7). 3D-реконструкция дендритов меланопсина продемонстрировала большие дендритные терминальные синаптические бутоны до 3-4 мкм в диаметре (Рисунок 6). Терминалы были обнаружены в тесном контакте с ножками стержня (рис. 6В). Анализ совместной локализации продемонстрировал перекрытие пикселей двух антигенов, что указывает на прямой синаптический контакт между ножками стержня и дистальными отростками меланопсина в OPL (рис. 6B).Дистальные дендриты меланопсина также были обнаружены в непосредственной близости к ножкам конуса L / M (Рисунки 6C, D). Внутри ножек конуса был обнаружен маркер синаптической ленты Ctbp2 (рис. 6D). Анализ совместной локализации после 3D-реконструкции выявил прямой синаптический контакт между меланопсин-содержащими отростками, ножками конуса L / M и маркером синаптической ленты Ctbp2 (рис. 6D).

Рис. 5. Меланопсин (зеленый), L / M конусный опсин (красный) и родопсин (синий) и контр-окрашивание DAPI (серый) в Spalax (A – E) .Меланопсин экспрессируется в RGC, расположенных в GCL и INL (B) . Опсин колбочек L / M экспрессируется в фоторецепторных клетках в ONL и замещается в INL (A, C, E) . Родопсин экспрессировался в фоторецепторных клетках, расположенных в ONL, и в смещенных клетках в INL (A, D, E) . Наиболее сильное иммуноокрашивание как в палочках, так и в колбочках было обнаружено в дегенерированном наружном сегменте (стрелки в C – E ). Масштабные линейки: (A) ; 70 мкм, (B – E) ; 35 мкм.GCL; слой ганглиозных клеток, IPL; внутренний плексиформный слой, INL; внутренний слой ядерной клетки, OPL; внешний плексиформный слой, ONL; внешний слой ядерной клетки, ОС; наружный (фоторецепторный) сегмент.

Рис. 6. Дендриты меланопсина были обнаружены в тесном сопоставлении со стержнями и колбочками, указывающими на синаптический контакт . Окрашивание меланопсином (зеленый), опсином колбочек L / M (красный) и родопсином (синий / серый) в Spalax (A) . Опсины палочек и колбочек экспрессировались в клеточной мембране сомы, во внутреннем сегменте и во внешнем сегментах (B – D) .В OPL дендритные отростки меланопсина находятся в тесном сопоставлении со стержневыми ножками (область в рамке в A показана с высоким увеличением в B ) и совместной локализацией, указывающей на синаптические контакты (определяемые модулем колокализации IMARIS ^® ), как показано фиолетовым. Лента, содержащая синапсы, визуализированные с помощью Ctbp2 (белый цвет на C, D можно найти на ножках L / M конуса OPL). Вероятный синаптический контакт между ножками конуса L / M и дистальными отростками меланопсина может быть обнаружен в OPL.В области рамки на C показаны фоторецепторные клетки опсина L / M колбочек, отвечающие за Ctbp2. При использовании модуля колокализации IMARIS перекрытие L / M конического опсина, CtBp2 и меланопсина обозначено стрелками на (D) и на вставке на Панели (D) (желтые точки, соответствующие области на C , указаны от *). Двойные стрелки в (D) показывают дегенерированный внешний сегмент в двух фоторецепторных клетках L / M-конуса. Сетка на панели (B – D) указывает, что изображение было создано в 3D.Масштабные линейки: (A) ; 40 мкм, (В) ; 5 мкм, (C) ; 50 мкм, (D) ; 10 мкм и вставьте в (D) ; 4 мкм. INL; внутренний слой ядерной клетки, OPL; внешний плексиформный слой, ONL; внешний слой ядерной клетки.

Рис. 7. RGC меланопсина (зеленый) иннервируются биполярными клетками, экспрессирующими реэктин (красный) в IPL / GCL (желтая рамка на A и при большем увеличении на H, I), и имеют прямой синаптический контакт с рековерин-содержащими фоторецепторными клетками в OPL, экспрессирующий Ctbp2, маркер для синаптических лент (белый) (белая рамка в A и сверхвысокое увеличение в C, G) .Панели (A – D) и панели (H, I) представляют собой трехмерные реконструкции, представляющие 65 сечений, разделенных расстоянием 0,2 мкм. Для большей наглядности одиночный цифровой разрез (E – G) , представляющий xy, xz и yz, показан дистального отростка меланопсина (обозначен стрелкой в ​​ E, G ) и контакта с восстанавливающимися ножками фоторецепторов (обозначен двойные стрелки), также содержащий синаптический маркер Ctbp2 (показан белым в F ). Синаптические контакты, в которых меланопсин имеет прямое перекрытие с совместной локализацией recoveryin / Ctbp2, обозначены стрелками синего цвета (C – G) .Синаптический контакт между меланопсином и рековерином, содержащим биполярные окончания, совместно хранящие Ctbp2, обозначены стрелками синего цвета в I. Шкала шкалы: (A) ; 10 мкм, (B, C) и (H, I) ; 5 мкм, (D) , (E – G) ; 2 мкм.

Рековерин обнаружен в фоторецепторных клетках и в подтипах биполярных клеток колбочек (Euler and Wassle, 1995). В Spalax мы также обнаружили рекуперин в клетках, несущих фоторецепторы, как в ONL, так и в INL (рис. 7).Трехмерный анализ подтвердил, что восстановленная положительная иммунореактивность на ножках клеток фоторецепторов costore Ctbp2 (Фигуры 7A, B, F) была обнаружена в тесном сопоставлении с дистальными отростками меланопсина в OPL, что указывает на синаптический контакт (Рисунок 7). Это демонстрируется на стопках цифровых срезов, используемых для трехмерных реконструкций и анализа совместной локализации, как показано на фиг. 7. При окрашивании реэктином INL наиболее вероятно окрашиваются клетки, экспрессирующие опсин смещенных колбочек, и биполярные клетки (фиг. 7). Восстановленные положительные клетки, расположенные во внутренней части INL, имели свои отростки, расположенные в IPL и близкие к соматам и отросткам меланопсина.Трехмерный анализ продемонстрировал четкое расположение иммунореактивности Ctpb2 в биполярных окончаниях в непосредственной близости к процессам меланопсина, что указывает на прямой синаптический контакт с восстановленными биполярными клетками и процессами меланопсина в IPL / GCL (Фигуры 7A, H, I).

Мы также использовали антитело, направленное против S-колбочек млекопитающих (таблица 1). Это антитело не показало какого-либо специфического окрашивания в соответствии с предыдущим исследованием (David-Gray et al., 2002). Ранее было показано, что это антитело иммуно метит S-колбочки у людей (Milam et al., 2002), мыши (Dkhissi-Benyahya et al., 2006), суслики (Sakai et al., 2003), а также Talpa occidentalis (Carmona et al., 2010).

Кальретинин, экспрессирующие амакриновые клетки, иннервируют RGC меланопсина

Кальретинин был обнаружен в различных подтипах клеток сетчатки в сетчатке млекопитающих, включая ганглиозные клетки, амакриновые и горизонтальные клетки (Lee et al., 2010, 2016). Иммуномечение кальретинина было обнаружено в INL, расположенном во внешней части INL, скорее всего, представляя горизонтальные клетки (рис. 8A).Большой контингент клеток, экспрессирующих кальретинин, был обнаружен во внутренней части INL, скорее всего, представляя субпопуляцию амакриновых клеток (Фигуры 8A – D), и в ганглиозных клетках в клетках, которые совместно хранят Brn3a (см. Выше). Кальретинин, расположенный в амакриновых клетках, был обнаружен в цитоплазме клеток и в дендритных отростках IPL и OPL (рис. 8). Многие отростки проникают через INL и заканчиваются в OPL в непосредственной близости к ножкам стержня и конуса L / M (Рисунки 8A, B). В IPL были обнаружены другие процессы без организации подуровня, как это было замечено ранее (Cernuda-Cernuda et al., 2002). Трехмерная реконструкция и анализ выявили, что содержащие кальретинин отростки IPL и GCL находятся в близком соприкосновении с дендритами меланопсина и мембраной сомы, скорее всего, обеспечивая синаптические контакты (Figures 8E-I).

Рис. 8. РГК меланопсина (зеленый) иннервируются кальретинином, экспрессирующими амакриновые клетки (красный). (A) Иммунореактивность к кальретинину в Spalax была обнаружена в амакриновых клетках во внутренней части INL и в клетках внешней части INL, которые могли быть горизонтальными клетками и в процессах, иннервирующих OPL в тесном контакте. со стержневыми фоторецепторами (синие).В процессах IPL / GCL кальретинин находится в тесном контакте с процессами меланопсина. Использование модуля совместной локализации IMARIS на 73 цифровых срезах, разделенных друг от друга на 0,2 мкм, используемых для трехмерной реконструкции, указывает на то, что синаптический контакт был обнаружен между сомой меланопсина и проксимальными отростками и аксонами кальретинина. Панели (D, E) представляют собой трехмерные изображения и для лучшей иллюстрации показаны отдельные цифровые секции (F – I) , представляющие изображения x-y, x-z и y-z клетки меланопсина, обозначенные *, а также отдельные каналы.Расчетная совместная локализация меланопсина и кальретинина в I указана стрелками. Масштабные линейки: (A) ; 50 мкм, (B) и (D) ; 20 мкм, (C) ; 15 мкм, (E) и (G) ; 10 мкм., (F – I) ; 5 мкм. GCL; слой ганглиозных клеток, IPL; внутренний плексиформный слой, INL; внутренний слой ядерной клетки, OPL; внешний плексиформный слой, ONL; внешний слой ядерной клетки.

PKC-α, который признан действительным маркером биполярных клеток палочек в зрячих глазах (Greferath et al., 1990) не было убедительно продемонстрировано в сетчатке Spalax , несмотря на использование нескольких различных антител, индуцированных против PKC-α, скорее всего, из-за видового различия PKC в Spalax .

Обсуждение

Настоящее исследование расширяет предыдущие наблюдения за Spalax , животным, которое адаптировало анатомию и физиологию к слепой подземной жизни и развило подкожные глаза со способностью ощущать окружающий свет для циркадной и фотопериодической регуляции (Sanyal et al., 1990; Cooper et al., 1993a, b; Дэвид-Грей и др., 1998). Глаза Spalax , хотя и сильно дегенерировали, без зрительной способности и с дегенерированной реорганизованной сетчаткой, экспрессируют три типа фоторецепторов, меланопсин, родопсин и опсин колбочек L / M. Большинство (87%) центральных выступов представляют собой меланопсин, экспрессирующие RGC, тогда как остальные RGC экспрессируют фактор транскрипции Brn3a и кальретинин. Зрячий глаз преобразует световую информацию от палочек и колбочек через биполярные клетки в GCL.Сетчатка Spalax устроена иначе. В Spalax прямые контакты между палочками, колбочками и меланопсин-содержащими дендритами, скорее всего, представляют собой синаптические контакты, в дополнение к входу от кальретинин-содержащих амакриновых клеток и биполярных клеток колбочек. Эти наблюдения предлагают сетчатку Spalax в качестве возможной модели для исследования системы NIF.

Мы использовали большое количество маркеров антител, которые были охарактеризованы на зрячей сетчатке, и обнаружили, что большинство примененных антител имеют такую ​​же специфичность в сетчатке Spalax .Нам не удалось идентифицировать дофаминергические или экспрессирующие VIP-ергические амакриновые клетки, хотя оба антитела окрашивают нейроны и нервные волокна в центральной нервной системе Spalax , что указывает на отсутствие VIP и дофаминергических амакриновых клеток в сетчатке Spalax . Мы также не смогли найти никаких доказательств того, что коротковолновые опсин-экспрессирующие фоторецепторы у Spalax ранее были обнаружены у других подземных видов, таких как Talpa occidentalis (Carmona et al., 2010).Мы не можем исключить существование вышеупомянутых клеточных систем, но вполне вероятно, что эволюционный отбор на системе обнаружения света Spalax может объяснить отсутствие этих систем.

Два различных типа RGC обнаружены в

Spalax Retina

Морфология сетчатки глаза Spalax была исследована как на световом, так и на электронном уровне (Cernuda-Cernuda et al., 2002). Ранее мы идентифицировали меланопсин в большой группе RGC, которые совместно экспрессируют нейропептид PACAP, нейромедиатор в ретиногипоталамическом тракте, иннервирующий SCN (Hannibal et al., 2002b). Здесь мы предоставляем более подробный анализ mRGC ​​и демонстрируем, что в сетчатке Spalax mRGC ​​составляют основной тип RGC (87%) с клеточными телами, расположенными как в GCL, так и смещенными в INL, подобно зрячей сетчатке. В Spalax мы не смогли классифицировать мРГК, как в сетчатке мыши и крысы (Schmidt and Kofuji, 2009; Schmidt et al., 2011b; Esquiva et al., 2013; Reifler et al., 2015). Однако подтипы могут существовать, поскольку по-разному расположенные mRGC ​​по-разному связаны с клеточными телами в GCL и INL и с разной стратификацией дендритных процессов.В зрячей сетчатке mRGCs участвуют в регуляции зрачкового светового рефлекса, которого нет у Spalax (Schmidt et al., 2011b). Меланопсин также не участвует в зрительных задачах, как предполагается для зрячей сетчатки (Allen et al., 2014; Storchi et al., 2015).

Общий подсчет клеток с использованием RGC-маркера RBPMS (Rodriguez et al., 2014) показывает, что ~ 900 RGC обнаруживаются в сетчатке Spalax в зависимости от метода, используемого для подсчета клеток. Это очень похоже на результаты предыдущего исследования Cooper et al.(1993a), сделанные на сетчатке с плоским креплением после ретроградного отслеживания от зрительного нерва. Мы провели подсчет центрального профиля (La Morgia et al., 2015) на сагиттальных срезах всего глаза. Мы применили подход «разделения секций», подсчитывая каждую третью секцию, чтобы минимизировать ошибки подсчета. Из-за возможности «перерасчета» в сагиттальных сечениях мы также предоставили исправленное число, используя уравнение Аберкромби (Guillery, 2002). Хотя этот метод должен гарантировать проблемы с перерасчетом, по сравнению с подсчетом клеток, полученным в горизонтальном разрезе, мы могли недооценить общее количество RGC после коррекции Аберкромби.Несмотря на расхождение в количестве mRGC ​​в зависимости от используемого материала, 87% экспрессируют меланопсин, и из этих 5% были вытеснены в INL. Количество смещенных мРГК меньше, чем в зрячих глазах, хотя доля смещенных клеток различается у разных видов млекопитающих. У людей замещается около 50% всех клеток меланопсина (Dacey et al., 2005), у ночных грызунов, таких как крысы и мыши (Nadal-Nicolas et al., 2014; Valiente-Soriano et al., 2014) ~ 5– 10% были смещены, в то время как у дневной травяной крысы, Arvicanthis niloticus , 25% RGC меланопсина перемещаются в INL (Langel et al., 2015). У Talpa occidentalis , другого слепого землекопа, mRGC ​​также были зарегистрированы как доминирующий тип RGC, хотя информации о количестве смещенных mRGC ​​или о плотности mRGC ​​не имеется (Carmona et al., 2010). До сих пор различному распределению смещенных мРГК не приписывалась функциональная роль, но вполне вероятно, что эти клетки получают разные синаптические входы от сетчатки, что представляет функциональное различие мРГК (циркадный захват, зрачковый световой рефлекс, ночное подавление мРГК). мелатонин, маскировочное поведение).

Мы также идентифицировали другую популяцию RGC в сетчатке Spalax . Эта субпопуляция характеризовалась экспрессией Brn3a, кальретинина и RBPMS. Было показано, что Brn3a совместно локализуется с RBPMS у мышей, тогда как субпопуляция mRGC ​​экспрессирует Brn3b, но не Brn3a (Galindo-Romero et al., 2013; Nadal-Nicolas et al., 2014; Rodriguez et al., 2014) . В Spalax Brn3a может представлять субпопуляцию Brn3a-положительных RGC, обнаруженных в зрячем глазу.Центральные выступы сетчатки в Spalax иннервируют несколько областей мозга, наиболее плотные проекции достигают SCN, но несколько областей в переднем и среднем мозге также иннервируются глазами (Bronchti et al., 1991; Cooper et al. , 1993б). Остается показать, действительно ли Brn3a, экспрессирующие RGCs в Spalax , нацелены на SCN и участвуют в циркадном времени, или эти проекции достигают других областей, участвующих в др. Связанных с NIF функциях. Интересно, что в нескольких исследованиях на зрячих животных были продемонстрированы немеланопсиновые ретинальные проекции в SCN, некоторые из которых могут представлять Brn3a, экспрессирующие RGC (Hannibal and Fahrenkrug, 2004; Hattar et al., 2006; Hannibal et al., 2014).

Организация RGC меланопсина и синаптический контакт с палочками и колбочками

RGC меланопсина в зрячем глазу могут быть охарактеризованы процессами расслоения как внутренние и внешние стратифицирующие клетки (Dacey et al., 2005; Schmidt and Kofuji, 2009), а исследования с помощью электронной микроскопии (ЭМ) показали, что mRGC ​​получают входные данные от биполярных и амакриновые клетки в слое 5 близко к INL и страте 1 близко к GCL (Belenky et al., 2003). В Spalax вход, по-видимому, исходит непосредственно от палочек и колбочек, а также от биполярных и амакриновых клеток.Дендриты меланопсина расслаиваются как в слое IPL, обнаруживаемом в зрячем глазу, так и в OPL, и, по-видимому, имеют прямой контакт с ножками стержня и конуса. Это значительная разница по сравнению с проекциями меланопсина в видимой сетчатке (Schmidt et al., 2011a). Мы использовали конфокальную световую микроскопию с большим увеличением с разрешением ~ 200 нм и идентифицировали потенциальные синапсы между палочками, колбочками и меланопсином, используя маркер синаптической ленты Ctbp2 (Schmitz et al., 2000; Sterling and Matthews, 2005) в сочетании с 3D анализ и компьютерный анализ совместной локализации.Одно ЭМ-исследование показало, что стержневые / конические ножки в Spalax содержат ленточные синапсы, как это обнаруживается в зрячей сетчатке. Такие синапсы были обнаружены рядом с внутренними сегментами фоторецепторов, а также в OPL (Cernuda-Cernuda et al., 2002). Наш подход обнаруживает тесный контакт между дистальными дендриттами меланопсина и ножками стержня и конуса с совместной локализацией Ctbp2, скорее всего, представляющих синаптические контакты. В исследовании Cernuda-Cernuda et al. (2002) фоторецепторы, экспрессирующие родопсин, были идентифицированы на уровне электронной микроскопии (ЭМ).Многие ножки фоторецепторов, расположенные в OPL, содержат синаптические ленты, а некоторые также расположены в INL. Мы обнаружили, что иммунореактивность родопсина локализована во внешнем (дегенерированном) сегменте и в мембране палочек, несущих фоторецепторные клетки, некоторые из которых были смещены в INL. Это согласуется с наблюдениями Cernuda-Cernuda et al. (2002). Впервые мы идентифицировали фоторецептор, экспрессирующий опсин L / W колбочек. Фоторецепторные клетки колбочек, как и стержни, располагались в основном в ONL, но их было меньше по количеству, чем стержней, и было обнаружено, что несколько клеток, несущих опсин колбочек, смещены в INL.Наши результаты обеспечивают анатомический субстрат для функционального появления зеленого конусообразного пигмента, о котором сообщалось ранее (Janssen et al., 2003). Эта перестройка процессов меланопсина может увеличивать и усиливать световую информацию для RGC меланопсина. S-конус-опсин не был обнаружен с помощью иммуногистохимии в нашей работе, что подтверждает гипотезу о том, что Spalax не содержит фотопигмента UVS / VS конуса (David-Gray et al., 2002). Однако S-опсин встречается у африканского землекопа ( Rodentia Bathyergidae ) (Peichl et al., 2004; Nemec et al., 2008) и у европейских слепышей ( Talpa europaea ) (Glosmann et al., 2008), у обоих были поверхностные глаза по сравнению с подкожным глазом у Spalax .

Меланопсиновые RGC иннервируются кальретинином, экспрессирующими амакриновые клетки и конические биполярные клетки

В дополнение к информации о входе света от внешней сетчатки, mRGC ​​также получают вход через амакриновые и биполярные клетки в Spalax . Предыдущие ЭМ-исследования зрячей сетчатки предоставили доказательства таких входов, некоторые из которых осуществляются через ленточный синапс (Belenky et al., 2003). Используя ленточный маркер и 3D-анализ с высоким разрешением, мы обнаружили ленточные синапсы в восстановившихся биполярных клетках, которые были в тесном контакте с процессами меланопсина в IPL, скорее всего, представляя синаптические контакты. Рековерин обнаружен в фоторецепторных клетках и подтипах биполярных клеток колбочек (Euler and Wassle, 1995). Наши находки подтверждают синаптические контакты между фоторецепторными клетками, экспрессирующими регенерин в OPL. Хотя мы не можем различать разные подтипы биполярных клеток колбочек, похоже, восстановленные положительные биполярные клетки колбочек с ленточными синапсами устанавливают синаптические контакты с дендритами mRGCs в OPL / GCL.Мы не можем исключить, что рекаверин-положительные клетки в INL могут быть смещенными клетками фоторецепторов колбочек, но их локализация делает более вероятными биполярные клетки. Функциональное значение этих входов в RGC меланопсина еще предстоит определить. Недавно было показано, что информация о цвете опосредуется RGC меланопсина (Walmsley et al., 2015). Поскольку глаза Spalax спрятаны за мехом, кожей и погребены в железе Хардера, кажется вероятным, что другие длины волн, кроме синего света 490 нм, через стержни и колбочки L / M могут влиять на выход системы меланопсина в мозг. .

Мы не обнаружили убедительного окрашивания PKC, который признан достоверным маркером биполярных клеток палочки (Greferath et al., 1990). Мы использовали несколько различных антител и обнаружили только слабое окрашивание в клетках INL, но из-за низкой интенсивности сигнала было невозможно определить тип клеток или проекции (не показаны). Хотя наличие входа в мРГК от палочковых биполярных клеток было продемонстрировано у обезьян (Jusuf et al., 2007) и у крыс (Ostergaard et al., 2007), еще предстоит доказать, что он существует в сетчатке Spalax . .

В заключение, наше исследование демонстрирует сложную схему сетчатки, используемую Spalax для обнаружения света с использованием родопсина, L / W колбочки опсина и меланопсина, предоставляет доказательства того, что основные проекции в мозг (87%) опосредуются через mRGC ​​и немеланопсиновый путь к мозгу существует в Spalax .

Авторские взносы

JH разработал идею исследования. А.А. доставил животных. JH и GE выполнили часть IHC и написали первый черновик.JH и GE сделали рисунки и дополнительные фильмы из изображений, полученных на iMIC. GE провела подсчет клеток и измерила дендритное поле. GE и JH завершили рукопись.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Датским биотехнологическим центром сотовой связи (JH) и грантом UA2010-48536273 из Университета Аликанте (GE).Благодарим Аниту Хансен за отличную техническую помощь при окрашивании ИГХ.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fnana.2016.00061

Список литературы

Аллен А. Э., Сторчи Р., Марсьяль Ф. П., Петерсен Р. С., Монтемурро М. А., Браун Т. М. и др. (2014). Определяемая меланопсином световая адаптация зрения мышей. Curr. Биол. 24, 2481–2490.DOI: 10.1016 / j.cub.2014.09.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Беленьки, М. А., Смераски, К. А., Провенсио, И., Солларс, П. Дж., И Пикард, Г. Э. (2003). Меланопсиновые ганглиозные клетки сетчатки получают синапсы биполярных и амакриновых клеток. J. Comp. Neurol. 460, 380–393. DOI: 10.1002 / cne.10652

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бронхти, Г., Радо, Р., Теркель, Дж., И Воллберг, З. (1991). Проекции сетчатки у слепого землекопа: исследование естественной дегенерации с отслеживанием WGA-HRP. Brain Res. Dev. Brain Res. 58, 159–170. DOI: 10.1016 / 0165-3806 (91)

-Z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кармона, Ф. Д., Глосманн, М., Оу, Дж., Хименес, Р., и Коллинсон, Дж. М. (2010). Развитие и функции сетчатки у «слепой» родинки. Proc. Биол. Sci. 277, 1513–1522. DOI: 10.1098 / rspb.2009.1744

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чернуда-Чернуда, Р., ДеГрип, У. Дж., Купер, Х.М., Нево, Э., и Гарсия-Фернандес, Дж. М. (2002). Сетчатка Spalax ehrenbergi. Новые гистологические особенности, подтверждающие измененную фотосенсорную роль. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 43, 2374–2383.

Google Scholar

Купер Х. М., Хербин М. и Нево Э. (1993a). Глазная регрессия скрывает адаптивное развитие зрительной системы у слепого подземного млекопитающего. Природа 361, 156–159.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Купер, Х.М., Хербин М. и Нево Э. (1993b). Зрительная система микрофтальмологического млекопитающего от природы: слепого землекопа Spalax ehrenbergi. [Рассмотрение]. J. Comp. Neurol. 328, 313–350.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Цуй, К., Рен, К., Солларс, П. Дж., Пикард, Г. Э. и Со, К. Ф. (2015). Устойчивость к травмам у собственно светочувствительных ганглиозных клеток сетчатки к экспрессии меланопсина. Неврология 284C, 845–853. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2014.11.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дейси, Д. М., Ляо, Х. В., Петерсон, Б. Б., Робинсон, Ф. Р., Смит, В. К., Покорны, Дж. И др. (2005). Ганглиозные клетки, экспрессирующие меланопсин, в сетчатке приматов сигнализируют о цвете и освещении и проецируются в LGN. Природа 433, 749–754. DOI: 10.1038 / nature03387

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дэвид-Грей, З.К., Беллингхэм, Дж., Муньос, М., Авиви, А., Нево, Э., и Фостер, Р.Г. (2002). Адаптивная потеря чувствительного к ультрафиолету / фиолетового (UVS / VS) опсина конуса у слепого землекопа (Spalax ehrenbergi). Eur. J. Neurosci. 16, 1186–1194. DOI: 10.1046 / j.1460-9568.2002.02161.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дэвид-Грей, З. К., Купер, Х. М., Янссен, Дж. У., Нево, Э. и Фостер, Р. Г. (1999). Спектральная настройка циркадного фотопигмента у подземного «слепого» млекопитающего (Spalax ehrenbergi). FEBS Lett. 461, 343–347. DOI: 10.1016 / S0014-5793 (99) 01455-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дэвид-Грей, З. К., Янссен, Дж. У., ДеГрип, У. Дж., Нево, Э. и Фостер, Р. Г. (1998). Обнаружение света у «слепого» млекопитающего. Нат. Neurosci. 1, 655–656. DOI: 10.1038 / 3656

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дхисси-Беняхья, О., Риэ, К., Хат, Р. А., и Купер, Х. М. (2006). Иммуногистохимическое доказательство наличия конуса меланопсина в сетчатке человека. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 47, 1636–1641. DOI: 10.1167 / iovs.05-1459

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эскива, Г., Лакс, П., и Куэнка, Н. (2013). Нарушение внутренних светочувствительных ганглиозных клеток сетчатки, связанное с поздними стадиями дегенерации сетчатки. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 54, 4605–4618. DOI: 10.1167 / iovs.13-12120

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фаренкруг, Дж., Буль, Т., и Ганнибал, Дж. (1995). Пептиды, производные от PreproPACAP, встречаются в опухолях, продуцирующих VIP, и сосуществуют с VIP. Regul. Pept . 58, 89–98.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Галиндо-Ромеро, К., Хименес-Лопес, М., Гарсия-Аюсо, Д., Салинас-Наварро, М., Надаль-Николас, Ф. М., Агудо-Барриузо, М. и др. (2013). Число и пространственное распределение собственно светочувствительных ганглиозных клеток сетчатки у взрослых крыс-альбиносов. Exp. Eye Res. 108, 84–93.DOI: 10.1016 / j.exer.2012.12.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Глосманн М., Штайнер М., Пайхл Л. и Анельт П. К. (2008). Конические фоторецепторы и потенциальное УФ-зрение у подземного насекомоядного, европейского крота. J. Vis. 8 , 23. 1–12. DOI: 10.1167 / 8.4.23

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Греферат У., Грюнерт У. и Вассл Х. (1990). Стержневые биполярные клетки в сетчатке млекопитающих проявляют иммунореактивность, подобную протеинкиназе С. J. Comp. Neurol. 301, 433–442. DOI: 10.1002 / cne.

0308

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ганнибал, Дж., Хиндерссон, П., Кнудсен, С. М., Георг, Б., и Фаренкруг, Дж. (2002a). Фотопигмент меланопсин присутствует исключительно в PACAP, содержащем ганглиозные клетки сетчатки ретиногипоталамического тракта. J. Neurosci. 22: RC191.

PubMed Аннотация

Ганнибал, Дж., Хиндерссон, П., Нево, Э., и Фаренкруг, Дж.(2002b). Циркадный фотопигмент меланопсин экспрессируется у слепого подземного землекопа Spalax. Нейроотчет 13, 1411–1414. DOI: 10.1097 / 00001756-200208070-00013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ганнибал, Дж., Канкипати, Л., Стренг, К. Э., Петерсон, Б. Б., Дейси, Д., и Гамлин, П. Д. (2014). Центральные проекции собственно светочувствительных ганглиозных клеток сетчатки у макак. J. Comp. Neurol. 522, 2231–2248.DOI: 10.1002 / cne.23555

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаттар, С., Кумар, М., Парк, А., Тонг, П., Тунг, Дж., Яу, К. В. и др. (2006). Центральные проекции ганглиозных клеток сетчатки, экспрессирующих меланопсин, у мышей. J. Comp. Neurol. 497, 326–349. DOI: 10.1002 / cne.20970

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаттар, С., Ляо, Х. В., Такао, М., Берсон, Д. М., и Яу, К. В. (2002). Меланопсин-содержащие ганглиозные клетки сетчатки: архитектура, проекции и внутренняя светочувствительность. Наука 295, 1065–1070. DOI: 10.1126 / science.1069609

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаттар, С., Лукас, Р. Дж., Мросовский, Н., Томпсон, С., Дуглас, Р. Х., Хэнкинс, М. В. и др. (2003). Меланопсин и фоторецептивные системы палочки-колбочки отвечают за все основные вспомогательные зрительные функции у мышей. Природа 424, 76–81. DOI: 10.1038 / nature01761

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джаганнатх, А., Hughes, S., Abdelgany, A., Pothecary, C.A., Di Pretoro, S., Pires, S.S, et al. (2015). Изоформы меланопсина опосредуют различные поведенческие реакции на свет. Curr. Биол. 25, 2430–2434. DOI: 10.1016 / j.cub.2015.07.071

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джайн В., Равиндран Э. и Дхингра Н. К. (2012). Дифференциальная экспрессия факторов транскрипции Brn3 в изначально светочувствительных ганглиозных клетках сетчатки у мышей. J. Comp.Neurol. 520, 742–755. DOI: 10.1002 / cne.22765

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янссен, Дж. У., Бови-Гертс, П. Х., Петерс, З. П., Боумейкер, Дж. К., Купер, Х. М., Дэвид-Грей, З. К. и др. (2000). Полнофункциональный стержневой зрительный пигмент у слепого млекопитающего. Аргументы в пользу адаптивной функциональной перестройки? J. Biol. Chem. 275, 38674–38679. DOI: 10.1074 / jbc.M008254200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янссен, Дж.У., Дэвид-Грей, З. К., Бови-Гертс, П. Х., Нево, Э., Фостер, Р. Г., и ДеГрип, У. Дж. (2003). Зеленый конусообразный пигмент у «слепого» землекопа Spalax ehrenbergi: функциональная экспрессия и фотохимическая характеристика. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 1287–1291. DOI: 10.1039 / B300059C

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юсуф П. Р., Ли С. К., Ганнибал Дж. И Грюнерт У. (2007). Характеристика и синаптическая связь меланопсин-содержащих ганглиозных клеток в сетчатке приматов. Eur. J. Neurosci. 26, 2906–2921. DOI: 10.1111 / j.1460-9568.2007.05924.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ла Морджиа, К., Росс-Сиснерос, Ф. Н., Короньо, Ю., Хнибал, Дж., Галласси, Р., Канталупо, Г., и др. (2015). Потеря меланопсина ганглиозных клеток сетчатки при болезни Альцгеймера. Ann. Neurol. 79, 90–109. DOI: 10.1002 / ana.24548

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Лангель, Дж. Л., Смейл, Л., Эскива, Г.и Ганнибал Дж. (2015). Центральные проекции меланопсина у дневных грызунов Arvicanthis niloticus. Фронт. Нейроанат. 9:93. DOI: 10.3389 / fnana.2015.00093

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Э. С., Ли, Дж. Й. и Чон, К. Дж. (2010). Типы и плотность калретинин-содержащих ганглиозных клеток сетчатки у мышей. Neurosci. Res. 66, 141–150. DOI: 10.1016 / j.neures.2009.10.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, С.К., Велтцин, Ф., Мэдиган, М. К., Мартин, П. Р., Грюнерт, У. (2016). Идентификация типов амакриновых, замещенных амакриновых и бистратифицированных ганглиозных клеток в сетчатке человека с помощью антител против кальретинина. J. Comp. Neurol. 524, 39–53. DOI: 10.1002 / cne.23821

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лукас Р. Дж., Хаттар С., Такао М., Берсон Д. М., Фостер Р. Г. и Яу К. В. (2003). Снижение зрачкового светового рефлекса при высокой освещенности у мышей с нокаутом меланопсина. Наука 299, 245–247. DOI: 10.1126 / science.1077293

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Милам, А.Х., Роуз, Л., Сидесиян, А.В., Баракат, М.Р., Тан, В.К., Гупта, Н. и др. (2002). Ядерный рецептор NR2E3 играет роль в дифференцировке и дегенерации фоторецепторов сетчатки человека. Proc. Natl. Акад. Sci. США 99, 473–478. DOI: 10.1073 / pnas.022533099

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Надаль-Николя, Ф.M., Jimenez-Lopez, M., Salinas-Navarro, M., Sobrado-Calvo, P., Alburquerque-Bejar, J.J., Vidal-Sanz, M., et al. (2012). Полное количество, распределение и коэкспрессия факторов транскрипции brn3 в ганглиозных клетках сетчатки взрослых крыс-альбиносов и пигментированных крыс. PLoS ONE 7: e49830. DOI: 10.1371 / journal.pone.0049830

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Надаль-Николас, Ф. М., Салинас-Наварро, М., Хименес-Лопес, М., Собрадо-Кальво, П., Вильегас-Перес, М.П., Видаль-Санз М. и др. (2014). Смещенные ганглиозные клетки сетчатки у крыс-альбиносов и пигментированных крыс. Фронт. Нейроанат. 8:99. DOI: 10.3389 / fnana.2014.00099

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Nemec, P., Cvekova, P., Benada, O., Wielkopolska, E., Olkowicz, S., Turlejski, K., et al. (2008). Зрительная система подземных африканских слепышей (Rodentia, Bathyergidae): сетчатка, подкорковые зрительные ядра и первичная зрительная кора. Brain Res.Бык. 75, 356–364. DOI: 10.1016 / j.brainresbull.2007.10.055

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нево Е., Иваниская И., Бейлс А. (2001). Адаптивное излучение слепых субтерранских кротовых крыс: наименование и пересмотр четырех видов-братьев и сестер надвидов Spalax Ehrenbergi в Израиле: Spalax Gallili (2n = 52), S. Golani (2n = 54), S. Carmeli (2n = 58) и С. Иудеи (2n = 60) . Лейден, Нидерланды: Издательство Bachkhuys.

Остергаард, Дж., Ганнибал, Дж., И Фаренкруг, Дж. (2007). Синаптический контакт между меланопсин-содержащими ганглиозными клетками сетчатки и палочковидными биполярными клетками. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 48, 3812–3820. DOI: 10.1167 / iovs.06-1322

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пайхл Л., Немек П. и Бурда Х. (2004). Необычные свойства конуса и прута у подземных африканских землекопов (Rodentia, Bathyergidae). Eur. J. Neurosci. 19, 1545–1558. DOI: 10.1111 / j.1460-9568.2004.03263.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Райфлер А. Н., Червенак А. П., Доликян М. Э., Бененати Б. А., Мейерс Б. С., Демерцис З. Д. и др. (2015). Сетчатка крысы имеет пять типов фоторецепторов ганглиозных клеток. Exp. Eye Res. 130, 17–28. DOI: 10.1016 / j.exer.2014.11.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Родригес, А. Р., Севилья Мюллер, Л. П., и Бреча, Н. К.(2014). РНК-связывающий белок RBPMS является селективным маркером ганглиозных клеток сетчатки млекопитающих. J. Comp. Neurol. 522, 1411–1443. DOI: 10.1002 / cne.23521

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сакаи, Т., Кальдероне, Дж. Б., Льюис, Г. П., Линберг, К. А., Фишер, С. К., и Джейкобс, Г. Х. (2003). Восстановление фоторецепторов конуса после экспериментального отсоединения и повторного прикрепления: иммуноцитохимическое, морфологическое и электрофизиологическое исследование. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 44, 416–425. DOI: 10.1167 / iovs.02-0633

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Саньял, С., Янсен, Х. Г., Де Грип, В. Дж., Нево, Э., и де Йонг, В. В. (1990). Глаз слепого землекопа, Spalax ehrenbergi. Рудимент со скрытой функцией? Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 31, 1398–1404.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Шмидт, Т. М., Чен, С. К., и Хаттар, С. (2011a).По своей природе светочувствительные ганглиозные клетки сетчатки: множество подтипов, различные функции. Trends Neurosci. 34, 572–580. DOI: 10.1016 / j.tins.2011.07.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмидт, Т. М., До, М. Т., Дейси, Д., Лукас, Р., Хаттар, С., и Матыниа, А. (2011b). Меланопсин-положительные по своей природе светочувствительные ганглиозные клетки сетчатки: от формы к функции. J. Neurosci. 31, 16094–16101. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.4132-11.2011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмидт, Т. М., и Кофуджи, П. (2009). Функциональные и морфологические различия между внутренне светочувствительными ганглиозными клетками сетчатки. J. Neurosci. 29, 476–482. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.4117-08.2009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмидт, Т. М., и Кофуджи, П. (2010). Влияние дифференциального пути колбочек на подтипы внутренних светочувствительных ганглиозных клеток сетчатки. J. Neurosci. 30, 16262–16271. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.3656-10.2010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмитц Ф., Кенигсторфер А. и Судхоф Т. К. (2000). RIBEYE, компонент синаптических лент: эволюционное путешествие белка дает представление о функции синаптических лент. Нейрон 28, 857–872. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (00) 00159-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сторчи, р., Милосавлевич, Н., Элефтериу, К. Г., Марсьяль, Ф. П., Орловска-Фейер, П., Бедфорд, Р. А. и др. (2015). Повышение поддерживаемой активности, вызванное меланопсином, повышает надежность зрительной реакции таламуса на смоделированном рассвете. Proc. Natl. Акад. Sci. США 112, E5734 – E5743. DOI: 10.1073 / pnas.1505274112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Валиенте-Сориано, Ф. Дж., Гарсия-Аюсо, Д., Ортин-Мартинес, А., Хименес-Лопес, М., Галиндо-Ромеро, К., Виллегас-Перес, М. П. и др. (2014). Распределение меланопсин-положительных нейронов у пигментированных мышей и мышей-альбиносов: данные о интернейронах меланопсина в сетчатке мышей. Фронт. Нейроанат. 8: 131. DOI: 10.3389 / fnana.2014.00131

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уолмсли, Л., Ханна, Л., Муланд, Дж., Марсьяль, Ф., Уэст, А., Смедли, А. Р. и др. (2015). Цвет как сигнал для включения циркадных часов млекопитающих. PLoS Biol. 13: e1002127.DOI: 10.1371 / journal.pbio.1002127

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Анатомия глаза — Офтальмологическая клиника Мурфилдс

Наши глаза могут быть маленькими, но они дают нам то, что многие люди считают самым важным из наших органов чувств — зрение.

Как работает зрение

Зрение возникает, когда свет попадает в глаз через зрачок. С помощью других важных структур глаза, таких как радужная оболочка и роговица, необходимое количество света направляется на хрусталик.

Подобно тому, как линза в фотоаппарате посылает сообщение о создании пленки, линза в глазу «преломляет» (изгибает) падающий свет на сетчатку. Сетчатка состоит из миллионов специализированных клеток, известных как палочки и колбочки, которые работают вместе, чтобы преобразовать изображение в электрическую энергию, которая отправляется на зрительный диск на сетчатке и передается с помощью электрических импульсов по зрительному нерву для обработки. мозг.

Анатомия глаза

Из чего состоит глаз

• Ирис: регулирует количество света, попадающего в ваш глаз.Он образует цветную видимую часть вашего глаза перед линзой. Свет проникает через центральное отверстие, называемое зрачком.
• Зрачок: круглое отверстие в центре радужной оболочки, через которое свет проходит в хрусталик глаза. Радужка контролирует расширение и сужение (расширение и сужение) зрачка.
• Роговица: прозрачная круглая часть передней части глазного яблока. Он преломляет свет, попадающий в глаз, на линзу, которая затем фокусирует его на сетчатке.Роговица не содержит кровеносных сосудов и чрезвычайно чувствительна к боли.
• Линза: прозрачная структура, расположенная за зрачком. Он заключен в тонкую прозрачную капсулу и помогает преломлять падающий свет и фокусировать его на сетчатке. Катаракта — это когда хрусталик становится мутным, а операция по удалению катаракты предполагает замену помутневшего хрусталика искусственным пластиковым хрусталиком.
• Хориоидея: средний слой глаза между сетчаткой и склерой.Он также содержит пигмент, который поглощает излишний свет, предотвращая затуманивание зрения.
• Цилиарное тело: часть глаза, которая соединяет сосудистую оболочку с радужной оболочкой.
• Сетчатка: светочувствительный слой, покрывающий внутреннюю часть глаза. Он состоит из светочувствительных клеток, известных как палочки и колбочки. Человеческий глаз содержит около 125 миллионов стержней, необходимых для зрения при тусклом свете. С другой стороны, колбочки лучше всего работают при ярком свете. В глазу имеется от 6 до 7 миллионов колбочек, и они необходимы для получения четкого точного изображения и различения цветов.Сетчатка работает так же, как пленка в фотоаппарате.
• Макула: желтое пятно на сетчатке в задней части глаза, окружающее ямку.
• Ямка: образует небольшое углубление в центре макулы и является областью с наибольшей концентрацией колбочек. Когда глаз направлен на объект, часть изображения, сфокусированная на ямке, является изображением, наиболее точно регистрируемым мозгом.
• Диск зрительного нерва: видимая (при осмотре глаза) часть зрительного нерва, также находящаяся на сетчатке.Диск зрительного нерва определяет начало зрительного нерва, где сообщения от колбочек и палочек покидают глаз через нервные волокна к зрительному центру мозга. Эта зона также известна как «слепая зона».
• Зрительный нерв: выходит из глаза у диска зрительного нерва и передает всю зрительную информацию в мозг.
• Склера: белая часть глаза, плотное покрытие, с помощью которого роговица образует внешнюю защитную оболочку глаза.
• Стержневые клетки — это один из двух типов светочувствительных клеток сетчатки глаза.Есть около 125 миллионов стержней, которые необходимы для того, чтобы видеть при тусклом свете.
• Конические клетки — это второй тип светочувствительных клеток сетчатки глаза. Сетчатка человека содержит от шести до семи миллионов колбочек; они лучше всего работают при ярком свете и необходимы для острого зрения (получение четкого и точного изображения). Считается, что существует три типа колбочек, каждый из которых чувствителен к длине волны разного основного цвета — красного, зеленого или синего. Другие цвета рассматриваются как комбинации этих основных цветов.

Последнее обновление: 16 ноября 2017 г.

Палочки-колбочки и меланопсин обнаруживают свет и темноту для модуляции сна независимо от формирования изображения

Abstract

Свет, обнаруживаемый в сетчатке, модулирует несколько физиологических процессов, включая циркадный световой захват и световой рефлекс зрачка. По своей природе светочувствительные ганглиозные клетки сетчатки (ipRGC) передают в мозг входящий в мозг световой поток, управляемый палочкой-конусом и меланопсином. Используя ЭЭГ и электромиограммы, мы показываем, что острый свет вызывает сон у мышей во время их активной ночной фазы, тогда как острая темнота пробуждает мышей во время их дневной фазы сна.Мы использовали линии мутантных мышей сетчатки, у которых отсутствуют ( i ) ipRGC, ( ii ) пути фототрансдукции палочек и колбочек или ( iii ) белок меланопсин, и показали, что влияние света и темноты на сон требует передачи сигналов как палочки-колбочки, так и меланопсина через ipRGCs и не зависит от формирования изображения. Мы также показываем, что, хотя острые световые импульсы преодолевают циркадные и гомеостатические стимулы для сна, при многократном воздействии света с использованием цикла свет / темнота 3,5 часа / 3,5 часа циркадные и гомеостатические стимулы перекрывают поступление света.Таким образом, помимо своей известной роли в согласовании циркадной физиологии с днем ​​и ночью, ipRGC также передают световую и темную информацию как от палочко-конусных, так и основанных на меланопсине путей для модуляции сна и бодрствования.

Сон контролируется двумя механизмами: гомеостатическим и циркадным (1). В гомеостатическом механизме длительное бодрствование увеличивает влечение ко сну, тогда как циркадный осциллятор разделяет сон в рамках цикла день-ночь. Для оптимального сна необходимо синхронизировать как гомеостатические, так и циркадные механизмы (2).Известно, что свет влияет на сон, главным образом за счет модуляции фазы циркадного осциллятора в процессе, известном как фотоувлечение (3). Однако свет также влияет на бдительность у людей, что указывает на возможную прямую роль света в состоянии сна и бодрствования (4). Кроме того, у крыс-альбиносов темные импульсы увеличивают количество быстрых движений глаз (REM) (5). В то время как регуляция сна с помощью циркадного осциллятора хорошо изучена, существует ограниченное количество исследований острого воздействия света и темноты на сон или пути сетчатки, ответственные за передачу этих сигналов в мозг.

У млекопитающих глаз является единственным светочувствительным органом для зрительных функций, формирующих и не формирующих изображение, таких как циркадное фотоувлечение, зрачковый световой рефлекс и ингибирование высвобождения мелатонина. Три типа фоторецептивных клеток: палочки, колбочки и меланопсин-экспрессирующие внутренне светочувствительные ганглиозные клетки сетчатки (ipRGC) отвечают за обнаружение света в сетчатке (6). Палочки и колбочки необходимы для формирования зрительных образов, тогда как ipRGC необходимы для зрительных функций, не формирующих изображение (7, 8).Световой ответ в ipRGC происходит как из собственного фотопигмент-зависимого ответа меланопсина, так и из световых сигналов, исходящих от палочек и колбочек (9, 10). Подобно другим RGC, присутствие света и темноты может сигнализироваться стержнями и конусами для ipRGC через пути включения или выключения (11). Путь включения активируется при переходах от темноты к свету, тогда как путь ВЫКЛЮЧЕНИЯ активируется при переходах от света к темноте. Либо палочкообразные фоторецепторы, либо ipRGCs достаточны для фото-увлечения, сужения зрачка или управления прямым воздействием света на поведение (12–18).У грызунов прямой путь сетчатки к вентролатеральному преоптическому ядру, происходящий по крайней мере частично из ipRGCs, обеспечивает морфологические доказательства того, что сон может напрямую регулироваться светом (19, 20). В настоящее время неизвестно, как палочки-колбочки и ipRGC влияют на сон в ответ на световые и темные сигналы.

Здесь мы показываем, что у мышей, ведущих ночной образ жизни, световые импульсы вызывают сон, а темные — бодрствование. Используя несколько линий мутантных мышей, мы показываем, что, как и при циркадном фото-увлечении, формирование изображения не требуется для модуляции сна.В отличие от циркадного фотоувлечения, которое может быть вызвано либо внутренней светочувствительностью ipRGC, либо палочками-колбочками, передающими сигналы через ipRGC, животные, у которых отсутствует функциональная фоторецепция на основе палочки-колбочки или меланопсина, проявляют значительный дефицит в остром свете -зависимые реакции во сне. Таким образом, пути на основе палочки-колбочки и меланопсина необходимы для модуляции эффектов света и темноты на сон независимо от формирования изображения.

Результаты

Стержневой конус и фоторецепция на основе меланопсина достаточны для фото-увлечения ритмов сна и бодрствования.

Чтобы исследовать влияние циркадного фото-увлечения на сон, мы записали ЭЭГ и электромиограммы (ЭМГ) для определения состояния сна (бодрствование, низковольтная, высокочастотная ЭЭГ с высокоамплитудной ЭМГ; не-REM [NREM], высокая -напряжение, низкочастотная ЭЭГ с низкоамплитудной ЭМГ; или REM, выраженная тета-активность в каналах ЭЭГ и низкая ЭМГ) взрослых мышей в условиях 12-часового цикла света / 12-часового темноты. Свет включался от ZT0–12 и выключался от ZT12–24. Мы использовали мышей смешанного фона C57Bl6 (B6) и 129.Ранее было показано, что линии B6 и 129 не различаются по общей продолжительности сна ни в светлый, ни в темный периоды (21). Чтобы определить вклад фоторецепции палочки-колбочки в сон, мы использовали мышей меланопсин-КО ( Opn4 ^{taulacZ / taulacZ} , именуемых здесь как MKO), у которых обнаружение света палочкой-конусом не нарушено, а внутренняя светочувствительность ipRGCs не нарушена. исключается (14). Чтобы определить индивидуальный вклад фоторецепции на основе меланопсина в сон, мы использовали «только меланопсиновых» мышей ( Gnat1 ^{— / —} ; Cnga3 ^{— / —} , называемых здесь MO), которые все еще сохраняют Фоторецепция на основе меланопсина, но и палочки, и колбочки не обладают способностью обнаруживать свет в результате мутаций в гене палочковидного трансдуцина ( Gnat1 ) и гене канала, закрытого циклическими нуклеотидами колбочки ( Cnga3 ) (6).В среднем мыши WT спали 71,5% ± 1,9% светлой части цикла 12:12 свет-темнота (LD) и 32,2% ± 2,7% темной части (рис. 1 A и C ). подтверждая, что фото-увлеченные ритмы сна цикла LD 12:12 ( n = 5; P = 0,001). Продолжительность сна была аналогична показанной на разных линиях мышей, что указывает на то, что наша смешанная линия B6 / 129 не ведет себя иначе, чем одна линия B6 или 129 (21). ANOVA на смешанной модели между разными генотипами показывает, что мыши MKO и MO световозвращают свои ритмы сна и бодрствования, аналогичные животным WT (WT, n = 5; MKO, n = 4; MO, n = 4 ; P = 0.18; Рис.1 A ). Мыши MKO спали 67,6% ± 3,2% на свету и 37,1% ± 1,7% в темноте ( n = 4, P = 0,002; Рис.1 C ), а мыши MO спали 67,5% ± 4,1%. на свету и 37,1% ± 2,2% в темноте ( n = 4; P = 0,02; рис. 1 C ), что указывает на то, что общее количество сна для всех генотипов одинаково и приближается к 50%. В соответствии с предыдущими сообщениями о том, что фоторецепция на основе палочки-колбочки или меланопсина достаточна для передачи световой информации на циркадный осциллятор, эти данные показывают, что любой из этих путей также может вызывать фото-увлечение во сне.

Рисунок 1.

Палочка-колбочка и фоторецепция меланопсина увлекают ритмы сна через ipRGC ( A ). Процент времени, в течение которого мыши спят (сумма NREM и REM / общее время для процента сна) отображается в зависимости от дневного времени, определяемого как «время Цайтгебера». дающий »время (ZT). Данные разбиты на интервалы в 1 час. Все мыши WT ( n = 5, черные), MKO ( n = 4, красные) и MO ( n = 4, синие) способны ограничивать сон светлой частью 12 часов / 12 часов. ч LD цикл.Серый фон указывает на то, что свет выключен; белый фон указывает на то, что индикаторы включены. ( B ) Процент сна у четырех мышей aDTA (оранжевый) выровнен и нанесен на график в зависимости от циркадного времени, определенного началом фазы сна (CT0). WT из A нанесен для справки (черный пунктир). ( C ) Процент сна в светлую и темную части дня у животных WT, MKO и MO показывает, что все три генотипа способны ограничивать свой сон светлой частью дня. Мыши aDTA нанесены на график со временем КТ, чтобы показать, что они разделяют сон и бодрствование на отдельные части дня (**, P <0.01). Все точки представляют собой среднее значение ± SEM.

ipRGCs опосредуют циркадное фото-увлечение сна.

Чтобы проверить, влияют ли пути формирования изображений на ритмы сна и бодрствования независимо от циркадного фотоувлечения, мы использовали мышей «меланопсин aDTA» (7). У этих животных ipRGC избирательно удаляются путем специфической экспрессии ослабленной версии субъединицы дифтерийного токсина A (aDTA) под контролем локуса меланопсина ( Opn4 ^{aDTA / aDTA} ). Ранее мы обнаружили, что мыши с aDTA имеют нормальное формирование изображения и интактные циркадные ритмы, но эти ритмы не соответствуют циклу LD (7).В соответствии с выводом о том, что животные с aDTA не обладают фотоинтенсивным движением колеса, ритмы сна мышей с aDTA также были свободными в течение всего цикла LD [вспомогательная информация (SI), рис. S1 A и B ]. Чтобы сравнить ритмы сна aDTA с ритмами сна животных WT, мы выровняли записи сна животных aDTA с началом фазы сна каждой мыши, которая была определена путем определения самой продолжительной части дня с количеством сна более 60%. (Рисунок.1 В ). Первая 1-часовая «ячейка» была обозначена циркадным временем (то есть CT 0). Мышей WT и aDTA сравнивали путем выравнивания CT0 в aDTA с ZT0 у мышей WT. Смешанная модель ANOVA показала, что у мышей aDTA были ритмы сна, подобные мышам WT (WT, n = 5; aDTA, n = 4; P = 0,75; Рис. 1 B ). Далее мы сравнили количество сна во время CT0-12 с CT 12-24 и обнаружили, что активная и неактивная фазы присутствовали в aDTA, как и у других мутантных мышей (aDTA, n = 4; P = 0.006; Рис.1 C ). Таким образом, эти данные указывают на то, что путь изображения, который остается интактным у мышей aDTA, не влияет на фото-увлечение во время сна.

Для острой световой индукции сна требуется палочкообразный конус и фоторецепция на основе меланопсина.

Резкое воздействие света в темную фазу цикла день-ночь подавляет активность мышей в движении колеса — эффект, известный как маскировка (22). Чтобы проверить, как острое воздействие света влияет на сон, мышей подвергали фотоувовлечению на цикл LD 12:12, а затем подвергали 3-часовому световому импульсу от ZT14 до ZT17 (рис.2 А ). Это период, когда гомеостатические и циркадные импульсы высоки для бодрствования. Различные используемые линии мутантных мышей (WT, MKO и MO) в это время имеют схожий исходный сон (WT, n = 5; MKO, n = 4; MO, n = 4; P = 0,18). У животных WT 3-часовой световой импульс значительно увеличивал продолжительность сна (NREM и REM вместе для расчета общего сна) с 35,65% ± 4,4% в течение базовой ночи до 65,36% ± 4,66% во время представления 3-часового периода. световой импульс ( n = 5; P = 0.006; Рис.2 B ). Процент сна во время светового импульса сопоставим с процентом времени, в течение которого мыши обычно спят в течение дня (рис. 1 C и рис. 2 B ). Это наблюдение показывает, что острый свет ночью может вызывать уровни сна, аналогичные дневным, возможно, за счет подавления как гомеостатических, так и циркадных импульсов.

Рис. 2.

Палочка-колбочка и фоторецепция меланопсина необходимы для поддержания индукции сна световым импульсом ( A ) Схема световой парадигмы, используемая в B – F .Серый контур обозначает контрольный период базовой ночи, а оранжевый прямоугольник указывает время появления света. Для B – F серый цвет представляет данные контрольной ночи, а желтый цвет представляет данные светового импульса. ( B ) Изменения общего сна во время светового импульса в WT ( n = 5), aDTA ( n = 3), MKO ( n = 5) и MO ( n = 4) мышей. Значительное увеличение сна наблюдалось только у животных WT. ( C – F ) Данные из B разделены на 30-минутные интервалы.( C ) Животные WT демонстрируют устойчивую индукцию сна. ( D ) Мыши aDTA не демонстрируют индукции сна световым импульсом. ( E и F ) Животные MKO и MO демонстрируют временную индукцию сна в начале светового импульса (*, P <0,05; **, P <0,01; и +, P <0,05, тест Стьюдента t только для 30-минутного бункера). Все точки представляют собой среднее значение ± SEM.

Чтобы выявить проводящие пути сетчатки, участвующие в этой острой световой индукции сна, мы аналогичным образом протестировали мышей MKO, MO и aDTA.При учете свободного бега животных с aDTA, они показывают такое же количество сна, что и другие мутанты между CT14 и CT17 (WT, n = 5; MKO, n = 5; MO, n = 4; и aDTA, n = 3, P = 0,28; рис.2 B ). Поскольку животные с aDTA свободно бегают, и мы можем точно оценить их период с помощью бега с колесом (рис. S1 A ), мы смогли заранее предсказать дни начала их сна и представить световой импульс только в тот день, когда их цикл сна согласован с циклом 12:12 LD (т.е., CT0 произошел в 7 утра при включении света). Мы обнаружили, что свет не вызывает увеличения сна у мышей aDTA, демонстрируя, что путь формирования изображения не играет роли в индукции сна светом ( n = 3, P = 0,36; Рис. 2 B и D ). Предыдущие сообщения показали, что световых импульсов на ZT14 достаточно для подавления активности бега колеса у животных, у которых отсутствуют либо палочка-конус, либо пути фоторецепции меланопсина (15, 18).Удивительно, но подобное воздействие света не смогло вызвать сон ни у животных MKO, ни у MO (MO, n = 4, P = 0,052; MKO, n = 5, P = 0,79; Рис.2 B ). Мы также исследовали изменения в REM-сне на протяжении световых импульсов и обнаружили, что REM-фаза изменяется пропорционально общему сну, так что не было значительных избирательных улучшений в REM-сне (рис. S2 A ).

Чтобы изучить изменения общего сна (т. Е. NREM и REM вместе) как функцию времени, мы разделили данные на 30-минутные интервалы.У животных WT свет индуцировал значительное увеличение сна в течение 3-часового светового импульса ( n = 5; P = 0,021; рис. 2 C ). Напротив, свет лишь временно способствовал сну у МО животных в начале импульса (30 мин, n = 4; P = 0,02; рис. 2 F ). Хотя мы не обнаружили общих изменений в индукции сна светом у животных MKO, в литературе появляется все больше доказательств того, что палочки и колбочки изначально вносят вклад в световую реакцию (23).Чтобы определить, влияют ли палочки и колбочки на начальную реакцию, мы проанализировали животных MKO для первой 30-минутной временной точки с помощью парного теста Стьюдента t и обнаружили, что свет первоначально вызывал значительное увеличение сна ( n = 5, P = 0,04; рис.2 E ). Этот анализ показывает, что собственный фотоотклик ipRGCs может играть большую роль в индукции сна, чем вход палочки-конуса через ipRGCs. Наконец, мы провели t сравнений тестов между животными WT и животными MKO, MO и aDTA для всего светового импульса и обнаружили, что свет индуцировал сон значительно больше у мышей WT по сравнению с другими мутантными линиями (WT, n = 5; МКО, n = 5, P = 0.03; МО, n = 4, P = 0,04; и aDTA, n = 3, P = 0,02; Рис.2 B ). Эти результаты демонстрируют, что устойчивый эффект света на сон зависит от комбинации фоторецепции на основе палочки-конуса и меланопсина.

Острое воздействие темноты вызывает бодрствование и требует наличия палочко-конусных путей и путей на основе меланопсина.

При использовании активности с бегом на колесах было показано, что мыши WT не увеличивают значительную активность во время темного пульса, представленного в дневное время (24).Однако запись ЭЭГ / ЭМГ является прямым показателем состояния сна и, следовательно, более точным представлением поведенческих изменений. Поскольку мы обнаружили, что свет вызывает сон у мышей, мы хотели исследовать, вызывает ли, наоборот, темнота бодрствование. Мы представили 3-часовой темный импульс от ZT2 до ZT5, когда и циркадный, и гомеостатический приводы мыши высоки для сна (рис. 3 A ). Мы обнаружили, что исходное время сна в течение дня одинаково для используемых нами мутантных линий (WT, n = 5; MKO, n = 4; MO, n = 4; и aDTA, n = 3; P = 0.12). Темный импульс вызывал бодрствование у мышей WT, вызывая значительное сокращение сна с 68,2% ± 8,1% в 3-часовой период контрольного дня до 42,1% ± 5,2% во время темного пульса ( n = 5, P = 0,006; рис.3 B ). Мыши MO также показали значительное изменение общего сна, но с меньшей величиной (69,5% ± 3,8% против 53,8% ± 2,5%, n = 4; P = 0,023). Однако тот же темный импульс не оказал сколько-нибудь значительного влияния на бодрствование в aDTA и MKO (aDTA, n = 3, P = 0.88; МКО, n = 4, P = 0,21; Рис.3 B ). Мы также проанализировали быстрый сон и не обнаружили значительных изменений в пропорциях быстрого сна во время темного пульса любого генотипа (рис. S2 B ). Эти результаты показывают, что и палочко-конусный, и меланопсин-зависимый пути ipRGC также необходимы для повышения уровня бодрствования WT в ответ на темный импульс.

Рис. 3.

Темный импульс вызывает бодрствование через ipRGC ( A ) Диаграмма воздействия темноты, используемая в B – F .Серый контур обозначает контрольный период базового дня, а синий прямоугольник указывает время темного представления. Для всех панелей в B – F серый цвет представляет данные контрольного дня, а синий цвет представляет данные темного пульса. ( B ) Изменения общего сна во время темного импульса в WT ( n = 5), aDTA ( n = 3), MKO ( n = 4) и MO ( n = 4) мышей. Значительное усиление бодрствования за счет темного пульса наблюдалось у животных WT и MO.( C – F ) Данные из B разделены на 30-минутные интервалы. WT ( C ), MKO ( E ) и MO ( F ) демонстрируют временную индукцию бодрствования, тогда как мыши aDTA ( D ) не реагируют на темное представление (*, P ). <0,05; **, P <0,01). Все точки представляют собой среднее значение ± SEM.

Чтобы оценить, присутствуют ли какие-либо переходные реакции в темновом импульсе, мы разделили данные на рис. 3 B на 30-минутные интервалы.Этот анализ выявил значительный начальный эффект темного пульса на пробуждение у животных WT, MKO и MO (30 мин, WT, n = 5, P = 0,006; MKO, n = 4, P = 0,03; и MO, n = 4, P = 0,03; рис.3 C , E и F ). Однако темнота не вызвала бодрствования у животных с aDTA (рис.3 D ), что указывает на то, что, как и световой сигнал, темный сигнал также проходит через ipRGC (рис.2 D и рис.3 D ). Подобно световым импульсам, мы обнаружили с помощью анализа теста Стьюдента t , что животные WT значительно отличались от животных MKO, MO и aDTA, несмотря на тот факт, что все генотипы значительно индуцировали переходное бодрствование (WT, n = 5; MKO , n = 4, P = 0,007; MO, n = 4, P = 0,002; aDTA, n = 3, P = 0,009). Темный сигнал был эффективным для пробуждения животных как MO, так и MKO.Эти результаты показывают, что ipRGC передают легкую реакцию выключения от стержней-колбочек, что является первым поведенческим свидетельством того, что ipRGC переносят функциональный сигнал выключения. Вместе отключение реакции палочки-колбочки и отключение передачи сигналов меланопсина вызывает более выраженную темновую реакцию у животных WT.

Хронические световые импульсы оказывают различное влияние на сон по сравнению с активностью при беге на колесах.

Чтобы исследовать влияние многократного воздействия световых импульсов на сон независимо от циркадного фотоувлечения, мы подвергали животных WT воздействию ультрадиана (т.например, короткий день) 7-часовой цикл LD (т.е. 3,5 ч / 3,5 ч LD). Мыши WT были выбраны для этого эксперимента, потому что они показали единственную надежную индукцию сна одним световым импульсом, что сделало их лучшими кандидатами для определения эффекта хронического воздействия. Мыши неспособны к фотоувлечению в этот более короткий цикл, поэтому светлая и темная части попадают во все фазы циркадного цикла (25). Это повторяющееся представление света и тьмы позволяет определить влияние хронических световых импульсов на сон.Было обнаружено, что свет вызывает сон в первом ультрадианном цикле; однако свет не вызывал сон постоянно в последующих циклах (рис. 4 A ). Кроме того, количественная оценка сна в ультрадианном цикле выявила очевидный циркадный ритм, который немного длиннее 24 часов (рис. 4 A и C ). В соответствии с идеей о том, что гомеостатический драйв не нарушен в ультрадианном цикле, количество полного сна (45,3% ± 3,7% против 48,6% ± 2,1%; n = 3, P = 0.25) и быстрый сон (5,22 ± 0,7 против 5,2 ± 1,24; n = 3, P = 0,98) сопоставимы в ультрадиановом и 24-часовом световых циклах (рис. 4 D ).

Рис. 4.

Хронические световые импульсы постоянно препятствуют движению колеса, но не способны вызывать сон постоянно. ( A и B ) Мыши WT, помещенные в ультрадиановые циклы LD 3,5 ч / 3,5 часа (светлый, белый фон; темный, серый фон), показывают, что свет не всегда вызывает сон ( A ) ( n = 4), но постоянно подавляет активность бега с колесами, измеренную у второй группы животных ( B ) ( n = 10).Нижняя ось x указывает номер цикла и условия освещения. Верхняя ось отображает часы с начала цикла 1. Синие столбцы показывают приблизительную область зон поддержания бодрствования в A и фазы, в которых циркадный ритм должен быть активным, в B . ( C ) Типичная двойная диаграмма активности сна для одной мыши в 12 ч / 12 ч LD (циркадный, d 1–10) и ультрадианный (d 11–18) парадигмы (белый фон, свет; серый фон, темнота. ).Черные отметки обозначают сон, а быстрый сон обозначается более высокими отметками. Красная стрелка показывает начало первого цикла ультрадианы. ( D ) Уровни общего сна и быстрого сна схожи между 12/12 LD (черный) и ультрадиановым (красный) световыми циклами ( n = 3). *, P <0,05.

Поскольку бег колеса является хорошо известной мерой влияния света на активность, мы исследовали, подавляют ли хронические световые импульсы ультрадианного цикла активность у второй группы мышей WT.Последовательное снижение активности вращения колеса наблюдалось при переходе от темноты к свету в ультрадианном цикле (10 из 12 переходов от темноты к свету показали значительное снижение, P <0,05; рис. 4 B ), что указывает на то, что свет способен многократно подавлять активность в течение нескольких дней. Даже в фазах, когда циркадный инстинкт активности мышей высок (рис. 4 B , синие столбцы), свет подавлял бегущую активность колеса (циклы 4, 5, 7, 8, 11 и 12, рис.4 В ). Напротив, очень немногие переходы из темноты в свет показали значительное увеличение сна (четыре из 12 показали значительное увеличение, P <0,05; Рис. 4 A ). Свет был особенно неэффективен в фазах, когда у животных, по-видимому, есть зона поддержания бодрствования (рис. 4 A , синие полосы). В отличие от простого бинарного управления активностью, связанной с движением колеса, эти результаты показывают, что порог для индукции сна с помощью света выше, чем порог для подавления активности, связанной с движением колеса, возможно, потому, что свет должен преодолевать как циркадные, так и гомеостатические механизмы.

Обсуждение

Сетчатка измеряет световую и темную информацию с помощью палочкообразных фоторецепторных клеток и сигнализирует об этих ответах в мозг через ВКЛЮЧЕННЫЕ и ВЫКЛЮЧЕННЫЕ ганглиозные клетки сетчатки (RGC). RGC, которые экспрессируют фотопигмент меланопсин (ipRGC), представляют собой третий тип фоторецептивных клеток в сетчатке млекопитающих. Подобно традиционным ганглиозным клеткам сетчатки, ipRGC также получают световые сигналы включения и выключения от палочек и колбочек (9, 10). В дополнение к формированию изображения сетчатка также сигнализирует о свете и темноте для нескольких физиологических функций, включая циркадное фото-увлечение.Здесь мы показываем на мышах, что острые световые и темные импульсы вызывают сон и бодрствование соответственно. Кроме того, фоторецепция на основе палочки-колбочки и меланопсина необходимы для полного воздействия света на состояние сна. Кроме того, сигнал палочки-конуса для сна и бодрствования направляется через ipRGC, что указывает на то, что формирование изображения не влияет на сон.

Поскольку мыши ведут ночной образ жизни, они в основном спят светлой частью дня. Поэтому мы решили подвергнуть мышей воздействию световых импульсов вскоре после наступления темноты, когда циркадный импульс к бодрствованию высок, а гомеостатическое стремление ко сну низкое.Чтобы вызвать сон в это время, световой сигнал должен преодолеть два сильных внутренних побуждения к бодрствованию. Наши результаты на мышах дикого типа показывают, что острый световой импульс вызывает сон до уровня, сопоставимого с дневным, тогда как мыши, у которых отсутствуют ipRGC, не реагируют ни на одну часть светового импульса. Этот результат показывает, что ipRGC необходимы для передачи светового сигнала центрам сна в головном мозге. Кроме того, ни палочка-конус, ни фоторецепция меланопсина сами по себе не смогли выдержать ответ на полный 3-часовой световой импульс.Необходимость совместной фоторецепции палочки-колбочки и меланопсина для опосредования острых реакций сна контрастирует с циркадным фото-увлечением и световым ингибированием активности вращения колеса, которые требуют только фоторецепции палочки-колбочки или меланопсина (12-17). Таким образом, система сна оказывается более чувствительной к потере фоторецепции на основе палочки-колбочки или меланопсина.

Мы также продемонстрировали, что темный импульс во время светлой части дня вызывал бодрствование у животных WT.Эта реакция удивительна, потому что темные импульсы не вызывают активности вращения колеса (24). Мы также показываем, что не было общего эффекта у животных, лишенных ipRGC (то есть aDTA). Даже когда данные анализировались в 30-минутных ячейках, животные с aDTA не проявляли реакции на какую-либо часть темнового импульса, тогда как мыши WT имели значительную реакцию бодрствования в течение 3-часового пульса. Это указывает на то, что ipRGC передают темный сигнал центрам сна / бодрствования в головном мозге. Удивительно, что клетки меланопсина передают темный сигнал, чтобы вызвать бодрствование, поскольку клетки меланопсина получают только слабый сигнал от пути выключения палочки-колбочки в сетчатке (11).Чтобы определить, какие фоторецептивные пути вносят вклад в этот темновой сигнал, мы проанализировали реакцию мышей MKO и MO на темновой импульс. Мы обнаружили, что оба генотипа имели значительные временные ответы в первые 30 минут. Это указывает на то, что фоторецепция палочки-колбочки и меланопсина способствуют обнаружению темноты для индукции бодрствования и что обе системы необходимы для того, чтобы вызывать реакцию после первых 30 минут. Хотя все животные WT, MKO и MO имели значительную временную индукцию бодрствования темным импульсом (рис.3 C , E и F ), величина ответа дикого типа в течение полных 3 часов была больше и значительно отличалась от других генотипов (рис. 3 B ). Более сильный WT-ответ указывает на то, что системы палочек-колбочек и меланопсина должны работать сообща, чтобы сигнализировать о темных реакциях в мозг. Это указывает не только на то, что ipRGC передают темную информацию от палочек и колбочек в мозг, но также на то, что белка меланопсина достаточно для обнаружения этой информации.Эти результаты являются функциональным доказательством того, что обнаружение темноты и передача сигналов с помощью ipRGC влияют на поведение.

Дифференциальное влияние света на сон и активность при беге на колесах было выявлено с помощью ультрадианового цикла LD 3,5 ч / 3,5 ч. В этой парадигме свет подавлял работу колеса почти во всех переходах от темного к светлому. В то время как свет индуцировал сон в первом ультрадиановом цикле, он не смог вызвать сон последовательно в последующих циклах. Таким образом, свет оказывает более слабое влияние на сон, чем на работу колеса.Одним из возможных объяснений этого различия является то, что центры сна, такие как вентролатеральное преоптическое ядро, получают более слабый вход от ipRGC, чем циркадные центры, такие как супрахиазматическое ядро ​​(20).

Здесь мы представляем пороговую модель, объясняющую, как свет по-разному влияет на быстрое засыпание по сравнению с ингибированием активности при движении колеса. Свет, обнаруживаемый палочками и колбочками (т. Е. Внешний) или путем фототрансдукции меланопсина (т. Е. Внутренний), передается в мозг через ipRGC, чтобы влиять на несколько функций, не формирующих изображение, в том числе циркадный фото-захват, зрачковый световой рефлекс. , маскировка (7) и быстрое засыпание (рис.2) В сетчатке, стимулированной светом, ipRGC могут быть активированы эксклюзивным внешним входом палочка-конус, только внутренним входом меланопсина или их комбинацией. Учитывая более высокую чувствительность адаптированной к темноте системы стержень-конус к свету, можно было бы предсказать, что первоначальная реакция ipRGC обычно будет включать вход от стержней-колбочек. Однако стержни и колбочки адаптируются к свету, что со временем приводит к уменьшению поступления от стержней и колбочек. Стоит отметить, что в электрических записях даже реакция меланопсина показывает световую адаптацию, но в меньшей степени по сравнению с палочками-колбочками (11).

Как эти базовые клеточные механизмы способствуют различному влиянию света на это поведение? Для животных WT ультрадиановый цикл показал, что свет вызывает изменения в активности бега с колесом быстрее, чем сон, что указывает на то, что порог для индукции сна выше порога активности бега с колесом. Этот более высокий порог для индукции сна позволил нам использовать лечение импульсами острого света в различных мутантных линиях, чтобы выявить различия в силе воздействия и показать новые взаимодействия между системами палочки-колбочки и меланопсина.Как и ожидалось, у животных MKO палочки-колбочки сначала увеличивают сон, но затем система палочки-колбочки адаптируется и не может поддерживать реакцию на свет. Это аналогично результатам, полученным с животными MKO для ингибирования активности бега на колесах с использованием аналогичной интенсивности света (15). Однако свет препятствует вращению колеса в течение первых 100 минут трехчасового светового импульса, тогда как свет вызывает сон только в течение первых 30 минут (рис. 2 E ).

Что касается бега на колесах, MO животные поддерживают подавляющую реакцию на свет, аналогичную WT-животным (26).Однако, в соответствии с нашей пороговой моделью, свет сначала вызывает сон у МО животных, но не поддерживает ответ (рис. 2 F ). Это первое различие в поведении между WT и MO при интенсивности света, которая активирует собственный световой ответ в ipRGC. Следовательно, хотя внешние и собственные световые реакции также адаптированы у животных WT, комбинации передачи сигналов через палочку-колбочку и системы меланопсина может быть достаточно для преодоления порога индукции сна на время светового импульса (рис.S3).

Во время представления этой работы было опубликовано исследование по изучению воздействия света на животных WT, животных с меланопсином-КО и животных, у которых отсутствуют палочки и колбочки в результате дегенерации внешней сетчатки (26). Между двумя исследованиями есть схожие результаты, но есть и некоторые фундаментальные различия; особенно те, которые касаются роли палочек-колбочек в индукции сна. Во-первых, в обоих исследованиях представлены острые световые импульсы в темной части 24-часового цикла LD. Однако длительность и время предъявления светового импульса различаются.Мы представили 3-часовой световой импульс через 2 часа после наступления темноты (ZT14), когда гомеостатический драйв для сна низкий. Однако Lupi et al. (26) представил 1-часовой световой импульс, начинающийся через 4 часа после наступления темноты (ZT16). В ZT16 животные бодрствовали на 2 дополнительных часа, и, следовательно, их гомеостатическое влечение ко сну было бы выше, чем в ZT14. Более высокое гомеостатическое влечение ко сну могло вызвать снижение порога индукции сна светом.

Во-вторых, для животных MKO оба исследования не обнаружили существенной разницы в индукции сна светом в течение продолжительности светового импульса.Однако наш 30-минутный интервальный анализ показал, что свет в значительной степени вызывает сон у животных MKO только на начальном этапе, что указывает на то, что палочки-колбочки вносят значительный вклад в индукцию сна светом.

В-третьих, как Lupi et al. В (26) использовались 1-часовые световые импульсы, мы «объединили» час 1 наших 3-часовых экспериментов с импульсами света, чтобы провести прямое сравнение с их результатами. Даже несмотря на то, что наши 1-часовые данные для животных с МО показали значительную индукцию сна (от 29,9% ± 9,7% контрольного дня до 50,25% ± 15%).3% импульсный день; P = 0,0069), что согласуется с данными Lupi et al. (26), есть важные различия в амплитуде и уровне поддержки светового отклика. Мы обнаружили, что количество индукции сна у МО животных было значительно меньше, чем у животных дикого типа в течение первого часа ( P = 0,022), что свидетельствует о важном вкладе палочек-колбочек для индукции сна. Напротив, результаты Lupi et al. (26) не показали различий в индукции сна между животными MO и WT.Наиболее экономным объяснением этого несоответствия могло быть более высокое гомеостатическое стремление ко сну, когда они вводили световой импульс на ZT16. Другая возможность — различные мутации, используемые для исключения попадания палочек и колбочек. Мы использовали мутации, которые функционально устраняют пути фототрансдукции палочки и колбочки, тогда как Lupi et al. (26) использовали мутации, приводящие к дегенерации палочек и колбочек. Несмотря на эти различия, наш 3-часовой световой импульс показал неспособность света поддерживать индукцию сна у животных с МО по сравнению с животными дикого типа.Эти результаты, в сочетании со способностью света вызывать сон у животных MKO, показывают, что как палочки-колбочки, так и меланопсин вносят вклад в индукцию сна светом.

Это исследование показывает, что сон и бодрствование модулируются взаимодействием между световыми и темными сигналами через палочко-конусные и основанные на меланопсине фоторецептивные пути. Наши результаты убедительно показывают, что на сон не влияет сознательное зрительное восприятие дня и ночи. Решающая роль как палочки-колбочки, так и системы меланопсина в опосредовании воздействия света на сон означает, что люди с дефицитом любого из путей сетчатки могут быть особенно уязвимы для острых эффектов света и темноты на сон и бодрствование.

Методы

Животные.

Использовали взрослых мышей-самцов смешанного фона B6 и 129. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональными правилами Университета Джона Хопкинса (Балтимор, Мэриленд).

Записи сна.

записей сна выполняли, как описано (27). Вкратце, мы прикрепили имплантат 2-канальной ЭЭГ и 1-канальной ЭМГ (Pinnacle Technology) к черепу мышей в возрасте от 4 до 12 месяцев под наркозом, индуцированным кетамином / ксилазином.Мышам давали 10 дней для восстановления в 12-часовом цикле LD перед переводом в клетку для записи сна. Затем мышей привязывали к предусилителю и давали 3 дня для акклиматизации к новой клетке и привязи перед началом записи. ЭЭГ и ЭМГ регистрировались 10-секундными сериями с частотой 200 Гц. Настройка фильтра высоких частот для обоих каналов ЭЭГ была установлена ​​на 0,5 Гц, а фильтрация низких частот была установлена ​​на 40 Гц. Сигналы ЭМГ подвергались высокочастотной фильтрации с частотой 10 Гц и подвергались отсечке нижних частот с частотой 100 Гц.Сигналы ЭЭГ и ЭМГ были усилены в 5000 раз и оцифрованы с точностью до 14 бит перед отправкой в ​​записывающее программное обеспечение. Регистрация сигнала производилась с использованием пакета сбора данных Sirena (Pinnacle Technology). Состояние сна было субъективно определено исследователем, слепым к лечению, на основе частоты и амплитуды волн ЭЭГ и ЭМГ с использованием Neuroscore (DSI). Поведенческое состояние было определено как бодрствование (низковольтная высокочастотная ЭЭГ с высокоамплитудной ЭМГ), NREM (высоковольтная низкочастотная ЭЭГ с низкоамплитудной ЭМГ) или REM (выраженная θ-активность в каналах ЭЭГ и низкая ЭМГ).

Общий сон, показанный на рис. 1 A – C был определен путем анализа 48 последовательных часов активности ЭЭГ и ЭМГ у каждой мыши и объединения 1-часовых интервалов между днями для всех генотипов. Животных с aDTA выровняли относительно друг друга для Фиг.1 B , обнаружив, что наибольшее время сна превышает 60%, что было названо неактивной фазой. Начало неактивной фазы (CT0) было просто первым 1-часовым интервалом этого периода.

Световые (рис. 2) и темные (рис. 3) импульсы подавались на фоне 12-часового / 12-часового цикла LD 1000 люкс.Люминесцентные лампы Sylvania 23-W Super mini Daylight использовались для всех световых циклов и световых импульсов в экспериментах со сном, показанных на всех рисунках. Для WT, MKO и MO световой импульс 1000 люкс вводился через 2 часа после наступления темноты (ZT14) и длился 3 часа. ZT 14–17 предыдущего дня использовался как контрольный период для светового импульса. Темновой импульс подавался через 2 часа после появления света на ZT 2 и длился также в течение 3 часов. Предыдущий день аналогичным образом использовался в качестве контрольного периода для темного пульса.

Чтобы выполнить аналогичные световые импульсы на животных с aDTA, мы отслеживали период свободного бега каждой мыши в течение нескольких дней или недель, пока начало пробуждения (CT12) не совпало с выключенным светом (ZT12).Затем в ZT14–17 подавали световой импульс. Таким образом, мы смогли управлять световым импульсом таким образом, чтобы контролировать циркадное время и световую среду. Точно так же темный импульс вводили в день, когда начало сна (CT0) совпадало с включенным светом (ZT0). Затем через 2 часа вводили темный импульс от ZT2 до ZT5.

Условия хронического светового импульса моделировали путем воздействия на мышей светового цикла Т7 (ультрадиана, 3,5 часа; 1000 люкс свет; 3,5 часа темнота) в течение 8 дней подряд.Регистрацию сна проводили у мышей в течение 10 дней в цикле LD 12 ч / 12 ч, а затем переключили на цикл ультрадианы и записывали непрерывно в течение 8 дней. Чтобы определить общие изменения сна в этом цикле, 72 часа последовательных данных были подсчитаны для трех мышей и усреднены для NREM, REM, общего сна и бодрствования.

Колесо-ходовая деятельность.

Упражнение «бег на всех колесах» выполняли на самцах мышей-самцов гибридов B6 / 129 в возрасте от 4 до 12 месяцев. Мышей содержали индивидуально в клетках с колесом на время эксперимента.Все условия освещения составляли ≈700 люкс, обеспечиваемые люминесцентными лампами General Electric Ecolux UltraMax Starcoat T8. Активность при беге колес отслеживали с помощью программного обеспечения VitalView (MiniMitter; Respironics) и анализировали с помощью ClockLab (Actimetrics).

У мышей aDTA активность бега на колесе (рис. S1 A ) использовали для измерения их периода свободного бега на фоне 12-часового / 12-часового цикла свет / темнота. Эти мыши были оснащены 9-дюймовым колесом (MiniMitter; Respironics). Мыши WT в ультрадиане (3.Цикл 5 ч / 3,5 ч LD) помещали в клетки с 4,5-дюймовым ходовым колесом.

Статистический анализ.

Сравнения общего сна у мышей WT, MKO, MO и DTA (рис. 1 A и B ) были выполнены с помощью GraphPad Prism с использованием смешанной модели ANOVA. Для сравнения количества сна в светлые и темные периоды использовался тест Стьюдента t с Microsoft Excel для сравнения между WT и другими мутантными линиями. Для рис.2 B , рис.3 B и рис.Процентное соотношение общего контроля S6 и общего времени импульса сравнивалось с использованием теста Стьюдента t в Microsoft Excel. На рис. 2 C – E и рис. 3 C – E в SigmaStat был проведен двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями и положительным анализом Тьюки для определения общих изменений с течением времени и определения конкретных периодов изменений. Общий процент сна и REM сравнивали на рис. 4 D с использованием теста Стьюдента t в Microsoft Excel.

Благодарности

Мы хотели бы искренне поблагодарить докторов наук.Стивену Локли, Марни Халперн, Реджи Курувилле и Хайцин Чжао за критический научный вклад в рукопись. Мы благодарим отдел биостатистики Университета Джона Хопкинса за помощь со статистикой. Наконец, мы хотели бы поблагодарить членов Mouse Tri-Lab на факультете биологии Университета Джонса Хопкинса за ценные обсуждения и советы. Эта работа была поддержана премией для молодых исследователей от Фонда Дэвида и Люсиль Паккард (S.H.).

Сноски

• ¹ Кому следует направлять корреспонденцию.Электронная почта: shattar {at} jhu.edu

• Вклад авторов: C.M.A., A.D.G., K.L.V. и S.H. спланированное исследование; C.M.A. и К.Л.В. проведенное исследование; C.M.A. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; C.M.A., A.D.G., K.L.V., D.S.M., T.A.L. и S.H. проанализированные данные; и C.M.A., D.S.M. и S.H. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.