Удобрение цветов янтарной кислотой: инструкция по применению для комнатных цветов, показания, как разводить таблетки

4. Обсуждение

Наши результаты показывают положительный эффект применения органических кислот на параметры корней, высоту растений и параметры цветения. Это указывает на то, что эти органические кислоты могут улучшить декоративную ценность Gazania как уличного декоративного растения.Как и предполагалось ранее, был отмечен сдвиг в структуре распределения ассимилятов. Увеличение времени демонстрации цветов в нашем эксперименте можно считать относительно аналогичным предыдущим результатам увеличения срока годности ваз за счет распыления лимонной кислоты на срезанную туберозу [9], лилию [10] и увеличение срока хранения свежесрезанного укропа [12]. . Однако здесь мы впервые сообщаем, что обе органические кислоты увеличивают продолжительность жизни прикрепившихся к растению цветков.

Более высокие растения в ответ на опрыскивание обеих органических кислот согласуются с более ранним отчетом об укропе [12], где было замечено, что как органические кислоты, так и их комбинация привели к образованию более высоких растений укропа.Анализ SEM предполагает, что увеличение длины цветоноса, по крайней мере, частично регулируется теми же факторами, которые вызывают увеличение высоты растения.

Eidyan et al. [9] отметили синергизм между некорневой подкормкой Fe и лимонной кислотой в увеличении размера луковиц туберозы. Сообщалось о снижении веса надземных луковиц за счет лимонной кислоты и некоторых комбинаций распыления лимонной кислоты и яблочной кислоты у лилии. Они предположили, что это могло быть связано с эффектом распределения углеводов этими органическими кислотами [10].Наши наблюдения об увеличении выделения углеводов корням согласуются с этими сообщениями. Мы можем предположить, что в этих экспериментах существовала аналогичная схема распределения по корневой системе, подобная тому, что мы заметили здесь, которая была ответственна за более крупные подземные луковицы у туберозы и снижение веса надземных луковиц у лилии.

Эндрюс рассматривал уровень N в листе [16] и концентрацию белка в листьях [17] как факторы, которые объясняют основную долю вариации в соотношении S: R (от побега к корню).Позже он пришел к выводу, что все воздействия окружающей среды на S: R часто механистически связаны с их влиянием на концентрацию белка в листьях [18]. Однако, хотя эти выводы могут быть применены к хорошо удобренным растениям, есть и другие идеи относительно отношения R: S с точки зрения управления стрессом. Для определения отношения R: S предлагается абсолютное количество подземного и надземного экологического стресса с учетом соотношения подземного и надземного экологического стресса и потенциала роста самого вида [19].В другом исследовании выживаемость проростков разных видов положительно коррелировала с распределением корней [20]. В нашем эксперименте мы можем рассматривать увеличение отношения R: S за счет применения органической кислоты как адаптацию растений к потенциальным стрессам окружающей среды. На вегетативные показатели, такие как высота растения и длина цветоноса, и в некоторых случаях накопление сухой биомассы, положительно сказывается наряду с повышенным соотношением R: S, поэтому мы можем сделать вывод, что эти обработки помогли растению адаптироваться и лучше реагировать на экологическую ситуацию за счет более эффективная корневая система, способствующая лучшему росту побегов.

Мы наблюдали диапазон отношения R: S (от 3,5% до 4,9% DW), который был ниже, чем то, о чем ранее сообщали Ниу и Родригес [21]. Они сообщили о соотношении R: S от 7 до 8% при посадке растений в более легкую среду (канадский сфагновый торфяной мох, перлит + увлажняющий агент), который может вызвать большее разрастание корней, чем то, что мы использовали (смесь садовой почвы, листового компоста и торф). Использование более легкой среды может увеличить скорость восстановления тонких корней, которые составляют большую долю в Gazania .В нашем эксперименте, возможно, более густая среда вызвала потерю части сверхтонких корней и корневых волосков во время процесса изоляции корня для утяжеления. Однако, поскольку эта потенциальная потеря одинаково повлияла на все виды лечения, ее нельзя рассматривать как источник отклонений в нашем исследовании. Наш более длительный экспериментальный период (150 против 90 дней) может быть еще одним аргументом, объясняющим эту разницу. Уменьшение отношения R: S по возрасту / размеру у травянистых растений хорошо задокументировано [22]. Тем не менее, для окончательного вывода может потребоваться больше данных о соотношении R: S у растения Gazania в различных условиях культивирования.

В отношении корней, сухой массы и времени появления цветков мы наблюдали значительные различия в реакции на внесенные концентрации лимонной кислоты. В случае яблочной кислоты, хотя не было значительных различий между применяемыми концентрациями, но в корне, сырой массе и сухой массе корня мы видим, что только более высокая концентрация считается значительно отличающейся от контроля. По сравнению с более ранними сообщениями, здесь мы наблюдаем большее сходство между ответами отдельных признаков на органические кислоты.По некоторым признакам более низкая концентрация дала хорошие результаты, которые дают нам представление о возможных различных паттернах реакции на концентрацию применяемых органических кислот. Поэтому мы предлагаем тестировать как более низкие, так и более высокие концентрации этих органических кислот, чтобы лучше понять этот вопрос.

Анализ SEM предлагает контролирующий эффект по сухой массе побегов на соотношение R: S. С другой стороны, это говорит о том, что на сухой и свежий вес корней положительно влияет биомасса побегов. Это может показаться контрастирующим и может вызывать вопросы.Можно сделать вывод, что наблюдаемое контролирующее влияние сухой массы побегов на соотношение R: S могло быть результатом уменьшения отношения R: S за счет увеличения размера / возраста растения. Это соответствовало бы предыдущему выводу, сделанному в обзоре литературы Уилсоном относительно уменьшения отношения R: S у травянистых растений с возрастом / размером, за исключением корнеплодов [22]. Наблюдение за зависимостью сухой и сырой массы корней от сухой массы побегов может служить представителем зависимости роста корней от выделенных побегами углеводов.Следовательно, было бы естественно ожидать, что корневая система большего размера будет поддерживаться более крупной системой побегов.

5. Заключение

Лимонная кислота и яблочная кислота, возможно, повлияли на распределение углеводов в сторону корневого распределения в нашем исследовании. Более сильная корневая система поддерживает лучшую систему побегов. Учитывая накопленные данные о влиянии лимонной кислоты и яблочной кислоты и о том, как они воздействуют на растения в относительно низких концентрациях, а также о стабильности между растениями из разных семейств, можно отметить отчетливую картину регулирующих эффектов.Тот факт, что они воздействуют на растения в низких концентрациях вместе с ингибирующим действием более высоких концентраций этих органических кислот, о котором сообщалось ранее, позволяет нам сделать вывод, что их содержание углеводов может не играть важную роль в создании наблюдаемых реакций. Поскольку это и экологически чистые, и недорогие агенты, кажется многообещающим продолжить работу по обобщению различных эффектов этих органических кислот на растения и понять механизм, с помощью которого они проявляют свое влияние на растения.

Кроме того, мы можем обратить внимание на использование моделирования структурных уравнений (SEM) в такого рода исследованиях; как мы видим здесь, это может помочь в краткой форме выявить и визуализировать ключевые важные моменты, представляющие интерес. Однако есть некоторые различия, видимые между результатами ANOVA и SEM, которые связаны с различием в алгоритме расчета. SEM-анализ придает больший вес корреляции между переменными, чем ANOVA. Объединив оба анализа, мы можем получить более полный результат.Для подтверждения предложенного пути эффектов и предложенной модели, будет интересна дальнейшая работа в различных условиях на одном и том же заводе. Митчелл [23] рекомендовал использовать SEM в качестве мощного инструмента для применения анализа путей к наборам данных наблюдений в области экологии и эволюции, и здесь мы видим положительную перспективу применения этого инструмента моделирования в исследованиях растений.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации данной статьи.

Для нормального роста пыльцевых трубок и оплодотворения требуется насос Ca2 + с плазматической мембраной растений

Абстрактные

Ca ²⁺ играют важную роль в росте и развитии растений, включая ключевые аспекты роста и оплодотворения пыльцевых трубок. Динамика сигнала Ca ²⁺ в значительной степени контролируется притоком (через каналы) и оттоком (через насосы и антипортеры). Геном Arabidopsis кодирует 14 насосов Ca ²⁺ , 10 из которых принадлежат к семейству аутоингибируемых Ca ²⁺ АТФаз (ACA), которые, как предполагается, активируются Ca ²⁺ / кальмодулином.Здесь мы показываем, что изоформа ACA9 экспрессируется главным образом в пыльце и локализуется на плазматической мембране. Было обнаружено, что три независимых T-ДНК [часть плазмиды Ti (индуцирующая опухоль), которая переносится в клетки растений] нарушения гена ACA9 приводят к частичной мужской стерильности. Комплементацию наблюдали с помощью слияния ACA9-желтый флуоресцентный белок (YFP), который обнаруживал локализацию на плазматической мембране. Пыльца мутанта aca9 продемонстрировала пониженный потенциал роста и высокую частоту прерванного оплодотворения, что привело к уменьшению завязывания семян более чем на 80%.Эти данные идентифицируют переносчик Ca ²⁺ плазматической мембраны как ключевой регулятор развития пыльцы и оплодотворения у цветковых растений.

Ca ²⁺ необходим для эукариотических клеток как важный вторичный посредник (передача сигналов), так и как структурный компонент ферментов и макромолекулярных комплексов («клеточное питание») (1). Хотя Ca ²⁺ необходим, высокие концентрации в цитоплазме также могут быть токсичными. В результате появилось множество различных систем, которые чувствуют, реагируют и регулируют цитозольный Ca ²⁺ .И растения, и животные используют комбинацию ионных насосов, антипортеров и унипортеров для контроля цитоплазматической динамики Ca ²⁺ (2, 3), включая семейство кальмодулин-активируемых ионных насосов Ca ²⁺ -ATPase: плазматическая мембрана Ca ²⁺ АТФаз (PMCA) у животных и аутоингибирование Ca ²⁺ ATPases (ACAs) у растений (4, 5). У мышей фенотипы, возникающие в результате нокаутированных мутантов различных PMCA, включают дефекты слуха и баланса (для PMCA2), мужскую стерильность (для PMCA4) и летальность (для PMCA1) (6, 7).Множество ген-специфических фенотипов подтверждают предположение, что АТФазы Ca ²⁺ эволюционировали для выполнения множества клеточных функций, некоторые из которых важны для развития многоклеточных организмов.

В растениях Ca ²⁺ участвует во многих физиологических процессах, включая рост кончиков пыльцевых трубок (8-17) и оплодотворение (18). Половое размножение у растений требует, чтобы пыльца (мужской гаметофит) подвергалась направленному росту, чтобы достичь зародышевого мешка (женский гаметофит) и вывести две сперматозоиды в восприимчивую синергидную клетку (19).В то время как инвазивные эксперименты, которые блокируют или изменяют сигналы Ca ²⁺ , как было показано, модулируют развитие и оплодотворение пыльцы, генетические доказательства, подтверждающие роль транспорта Ca ²⁺ , до сих пор отсутствуют.

В Arabidopsis имеется 14 насосов Ca ²⁺ из двух различных семейств (20) [10 ACA и 4 Ca ²⁺ ATPases (ECAs) типа эндоплазматического ретикулума]. Хотя ACA наиболее тесно связаны с АТФазами Ca ²⁺ плазматической мембраны животных, они отличаются ( и ), имеющими изоформы, расположенные в эндоплазматическом ретикулуме и тонопласте, в дополнение к плазматической мембране и ( ii ) их регулируемый кальмодулином аутоингибитор расположен на N-конце вместо C-конца (21–23).Основываясь на сходстве аминокислот и положениях интронов, ACA можно разделить на 4 подсемейства (20), при этом ACA8, ACA9 и ACA10 составляют подсемейство 4 (рис. 1 a ). Один член этого подсемейства, ACA8, ранее был локализован на плазматической мембране (23).

Диаграммы, показывающие взаимосвязь ACA9 с другими насосами Ca ²⁺ в семействе P _2B и положения нарушений гена Т-ДНК.( a ) Дерево последовательности расстояний для P _2B Ca ²⁺ -ATPases в A . thaliana , на основе исх. 20. ПМ, плазматическая мембрана; ER, эндоплазматический ретикулум. ( b ) Карта вставок Т-ДНК в ACA9 . Показаны границы Т-ДНК для левого (L) и правого (R). Цифры указывают точку вставки Т-ДНК, как указано как положение нуклеотида ниже стартового кодона в положении 1. Вставки Т-ДНК в aca9 — 2 и aca9 — 3 вставлены в экзоны, тогда как Вставка Т-ДНК в aca9 — 1 вставлена ​​на границе экзон-интрон.( c ) Siliques от самоопыленных и реципрокных скрещиваний между aca9 и растениями WT. Справа показан увеличенный вид кремнезема, очищенного этанолом. Указан процент посевного материала по секторам ( n = 198 стручков).

Здесь мы предоставляем доказательства того, что ACA9 функционирует в плазматической мембране пыльцевой трубки и является ключевым регулятором роста и оплодотворения пыльцевой трубки. Было показано, что три независимых нарушения гена ACA9 приводят к полуостерильному фенотипу.Этот фенотип происходит из-за двух дефектов мужского гаметофита. Во-первых, мутантные пыльцевые трубки демонстрируют пониженную скорость роста и потенциал роста (то есть длину). Во-вторых, мутантные пыльцевые трубки, которые достигают семяпочки, демонстрируют высокую частоту прерванного оплодотворения. Наши результаты предоставляют генетические доказательства роли переносчика Са ²⁺ в росте пыльцы и оплодотворении.

Материалы и методы

Выделение мутантов вставки Т-ДНК.Мутанты были идентифицированы с помощью скрининга на основе ПЦР Т-ДНК Arabidopsis thaliana (Wassilewskija-2) [часть Ti (индуцирующей опухоль) плазмиды, которая переносится в клетки растений] мутантных вставок, созданных в Университете Висконсина Arabidopsis нокаутирующее устройство (24). Три разных мутанта aca9 [ aca9 — 1 (ssJH № 108), aca9 — 2 (ssJH № 109) и aca9 — 3 (ssMP № 22)] были идентифицированы, и все они несли маркер устойчивости к канамицину во вставке Т-ДНК.Растения, гомозиготные по вставке Т-ДНК, были идентифицированы по неспособности амплифицировать полосу WT с использованием ACA9-специфических праймеров, фланкирующих вставку. Пограничные фрагменты Т-ДНК амплифицировали и секвенировали для каждой вставки, чтобы проверить сайт вставки.

Конструкции плазмид и трансформация растений. Растения трансформировали с использованием Agrobacterium (GV3101) и методом окунания цветов (25). Для всех плазмид, полученных с помощью ПЦР, кодирующие последовательности секвенировали, чтобы гарантировать отсутствие ошибок ПЦР.

ACA9-промотор :: конструкция GUS (пс № 533). Последовательность 1,171 п.н. перед стартовым кодоном ATG ORF ACA9 амплифицировали с помощью ПЦР из ДНК Arabidopsis Ws-2 и вставляли в вектор pGreen (26), несущий маркер устойчивости к гигромицину. Репрезентативными линиями трансгенных растений, экспрессирующих эту конструкцию, являются ssJH №№. 468–470.

Конструкция ACA9-промотор :: ACA9-YFP (пс №580). Геномная / кДНК-гибридная последовательность ACA9 (At3g21180) была сконструирована из ПЦР-амплифицированных фрагментов кДНК и геномной ДНК (экотип Col) и вставлена ​​вместе с последовательностью промотора ACA9 в вектор pGreen, несущий маркер устойчивости к гигромицину. T ₂ растений из шести независимых линий были визуализированы с аналогичными результатами (линии растений ss № 471–473 и ss № 474–476 в aca9 — 1 и aca9 — 2 фонов, соответственно) .

Конструкция ACA9-промотор :: GFP (пс № 536). Последовательность промотора ACA9 была вставлена ​​в вектор pBIN (несущий маркер устойчивости к basta (27) и модифицирована для экспрессии слитых GFP ниже промотора 35s (28). Репрезентативные линии трансгенных растений, экспрессирующие эту конструкцию, представляют собой ss nos.456 , 460 и 464, в родительском фоне, соответствующем aca9 — 1, aca9 — 2 и Ws соответственно.

Конструкция ACA8-промотор ACA9 :: ACA8-GFP-TAP2 (пс № 534) была основана на векторе pGreen, несущем маркер устойчивости к гигромицину. Репрезентативными линиями трансгенных растений, экспрессирующих эту конструкцию, являются ssJH №№. 480 и 483 в фонах aca9 — 1 и aca9 — 2 соответственно.

Прорастание пыльцы. Пыльцу проращивали на агаризованной среде с 1% агаром, 80 ppm борной кислоты, 5 мМ CaCl ₂ , 20% сахарозой и 10 ppm мио-инозитолом (pH 5.8) и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре и влажности 100%.

Конфокальная микроскопия. Изображения зеленых и желтых флуоресцентных белков (GFP и YFP) были получены на конфокальной системе Bio-Rad MRC1024, присоединенной к микроскопу Zeiss Axiovert 100TV, с использованием объектива × 63 (NA1.4), набора эмиссионных фильтров 522-DF35 и лазер на смеси газов на криптоне и аргоне для генерации линии возбуждения 488 нм. Изображения дифференциального интерференционного контраста (ДИК) были собраны в той же системе с использованием одного детектора проходящего света.Псевдоцветные изображения были объединены с использованием программного обеспечения openlab Improvision (Lexington, MA).

Окрашивание анилиновым синим. Пестики фиксировали в 10% уксусной кислоте, 30% хлороформе и 60% этаноле в течение 2 часов, инкубировали в 4 М NaOH в течение 10 минут, трижды промывали 50 мМ фосфатом калия (pH 7,5) и затем окрашивали в течение 12 часов. с 0,05% анилиновым синим в 50 мМ фосфате калия (pH 7,5) (29). Пестики слегка сдавливали между предметным стеклом и покровным стеклом и фотографировали камерой Leica DC 300F, установленной на микроскопе Leica (Дирфилд, Иллинойс) MZ FL III, с использованием возбуждения 425/40 нм и длиннопроходного фильтра 475 нм.

ПЦР в реальном времени. Примерно 100 нг тотальной РНК, экстрагированной из ткани Arabidopsis , подвергали обратной транскрипции с использованием либо праймера 5′-AAT TGC TAG TGG CCA GCT GAC-3 ‘, специфичного для ACA9, либо праймера 5′-GTC GAT триозофосфатизомеразы (At3g55440) AAA CTC AGG CTT A-3 ′. Реакции ПЦР в реальном времени проводили на Roche Lightcycler с использованием красителя LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche) и пар праймеров 5’-TAG CCA AGA AAA TAA CGG TGA T-3 ‘, 5’-TTG TTA TAA GAG GTT CCC TTC T-3 ‘для ACA9 и 5′-TTT CAC TGG TGA AGT GAG TG-3′, 5’-GTC GAT AAA CTC AGG CTT TA-3 ‘для триозофосфат-изомеразы (контроль нормализации).Для анализа данных использовалось программное приложение q-gene (30).

Комплементация дрожжевых мутантов. Конструкции, кодирующие полноразмерный ACA9 и усеченный ACA9ΔN (без первых 93 аминокислот), были сконструированы в вектор экспрессии дрожжей (pYES2, Invitrogen) под контролем индуцируемого галактозой промотора. Saccharomyces cerevisiae штамм K616 (MATa, pmr1 :: HIS3, pmc1 :: TRP1, cnb1 :: LEU2, ura3 ) (31) был трансформирован плазмидами pYES2-pYES2-ESNA9, и пустой вектор pYES2 с использованием методов LiOAc / полиэтиленгликоль (PEG) (32).Аналогичным образом штамм K601 ( MATa, leu2, his3, ade2, trp1, ura3 ) трансформировали пустым вектором pYES2. Трансформанты были отобраны для прототрофии урацила путем посева на дрожжевую среду, содержащую 2% глюкозы, 2% бакто-агара, 50 мМ янтарной кислоты (pH 5,5), 0,7% (вес / объем) дрожжевого азотного основания, 30 мкг / мл аденина, 30 мкг / мл. мкг / мл каждой из аминокислот his, leu и trp и 10 мМ CaCl ₂ и инкубируют при 30 ° C в течение 3 дней. Колонии Ura ⁺ выращивали в аналогичной среде без агара при 30 ° C до достижения OD ₆₀₀ 0.5 и 7 мкл дрожжевой культуры помещали в виде капель на четыре разные среды: 2% глюкозы или галактозы, 2% бакто-агара, 50 мМ янтарной кислоты (pH 5,5), 0,7% (вес / объем) азотного основания дрожжей, 30 мкг / мл аденина, 30 мкг / мл каждой из аминокислот his, leu и trp и либо 10 мМ CaCl ₂ , либо 10 мМ EDTA.

Тесты наложения кальмодулина. Фрагмент ACA9 длиной 247 пар оснований, кодирующий Met-40 на Ala-95, амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в плазмиду pGEX-4T (Amersham Pharmacia Bioscience), что привело к N-концевому слиянию с глутатион- S -трансферазой.Слитый белок экспрессировали в штамме E. coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen) стандартными процедурами. Лизат цельных клеток (50 мкг белка) разделяли с помощью SDS / PAGE и наносили электроблоттинг на мембрану Immobilon-P (Millipore). После ренатурации мембраносвязанных полипептидов с использованием градиента гуанидин-HCl (4 M, 3 M, 1 M и 0,1 M) в трис-солевом буфере (25 мМ NaCl / 25 мМ Трис · HCl, pH 7,5 / 1 мМ DTT / 5 мМ MgCl ₂ ), мембрану покрывали 1% BSA в том же буфере с 0.04% Tween 20, но без гуанидин-HCl, а затем зондирование с помощью биотинилированного кальмодулина бычьего мозга (Calbiochem) в соответствии с протоколом производителя в присутствии 1 мМ CaCl ₂ или 5 мМ EGTA.

Результаты

Нарушения гена ACA9 приводят к уменьшению набора семян. Для исследования биологических функций транспортеров Ca ²⁺ в растениях мы идентифицировали растения, несущие разрывы Т-ДНК во всех 14 насосах Arabidopsis Ca ²⁺ .В отличие от животных (7), в лабораторных условиях не было обнаружено существенного значения одного насоса, о чем свидетельствует способность восстанавливать жизнеспособные гомозиготные растения для каждого из 14 нарушений генов. Тем не менее, фенотип частичной стерильности наблюдался для нарушений ACA9 , как впервые было замечено неменделирующей сегрегацией гомозигот (4,8% — / — против ожидаемых 25%, n = 1899, P <0,0001). .

Три независимых мутанта ACA9 ( aca9 — 1, aca9 — 2 и aca9 — 3 , рис.1 б ) были идентифицированы с помощью ПЦР-скрининга коллекции растений, трансформированных Т-ДНК (24). Все гомозиготные растения aca9 давали более короткие стручки с 80% меньшим количеством семян на стручок (т. Е. 5–8 семян) (рис. 1 c ). ). Подсчет семян варьировал в зависимости от условий культивирования. В Копенгагене типичные урожаи составляли aca9, = 4,9 ± 0,5 и WT WS-2 = 56,2 ± 1,4; в Сан-Диего типичная урожайность составила aca9 = 7,8 ± 2,4 и WT WS-2 = 47.2 ± 2.7. Второй особенностью этого фенотипа было неравномерное распределение семян внутри стигмы, 96% семян располагались в верхней половине (конец рыльца) (рис. 1 c ). Врезка ).

Доказательства того, что фенотип уменьшенного завязывания семян был результатом нарушения гена в ACA9 , были подтверждены комплементацией. Мутант aca9 — 1 растения трансформировали ACA9 , слитым с YFP и экспрессируемым под контролем промотора ACA9 .В линиях трансгенных растений второго поколения, гомозиготных по конструкции ACA9-YFP , набор семян восстанавливали до уровней, близких к уровням WT (средний набор семян на стручок = 40,6 ± 2,2, n = 3 трансгенных линии). Таким образом, три независимых нарушения гена и комплементация указывают на то, что плохой набор семян является результатом потери функции гена ACA9 (т.е. «нокаут»).

aca9 Пыльцевые пробирки показывают дефекты роста и оплодотворения. Чтобы определить биологическую основу фенотипа уменьшенного набора семян, мы инициировали реципрокные скрещивания между мутантами и дикими животными. Когда мутантную пыльцу использовали для удобрения цветка дикого растения, мы всегда получали очень плохой набор семян, сравнимый с самоопыляющимся растением aca9 (- / -). Напротив, когда пыльцу WT использовали для оплодотворения мутантного цветка, у некоторых стручков был восстановлен полный набор семян (рис. 1 c Верхний правый ). Чтобы дополнительно проверить фенотипический вклад женского гаметофита, мы использовали пыльцу WT для оплодотворения гетерозиготного мутанта aca9 (i.е., 50% материнских родительских семяпочек = aca9 ). Путем генотипирования потомства этого скрещивания мы наблюдали ожидаемое соотношение 1: 1 wt и aca9 аллелей (F ₁ = 48% aca9 (- / +), n = 350, P <0,0001) . Вместе эти результаты показывают, что снижение фенотипа семян является результатом одного дефекта пыльцы без значительного влияния женского гаметофита.

Пыльца мутанта aca9 имеет два дефекта.Во-первых, они показали пониженный потенциал роста in vivo, и in vitro, . Окрашивание анилиновым синим пыльцы, прорастающей через пестики, показало, что пыльцевые трубки aca9 имели на 90% сниженную частоту достижения базального конца пестика (рис.2 a и b ). С течением времени роста пыльцы снижение скорости роста стало заметным примерно к 5 часам (рис. 2 c ). Этот пониженный потенциал роста согласуется с тестами in vitro , которые показывают примерно 75% уменьшение длины мутантных пыльцевых трубок по сравнению с диким растением (через 24 часа 99.1 ± 20,1 мкм против 378,1 ± 40,8 мкм). Этот пониженный потенциал роста частично объясняет наблюдаемую тенденцию к успешному оплодотворению на конце рыльца пестика (рис. 1 c Врезка ).

aca9 пыльцевые трубки показывают дефекты потенциала роста и взаимодействия с семяпочками.( a ) Примеры пестиков aca9 и WT, окрашенных анилиновым синим (29), чтобы показать положения самых длинных пыльцевых трубок. ( b ) Фракция пестиков растений WT и aca9 с пыльцевыми трубками, достигающими базальной трети пестика, по сравнению с трубками, доходящими до дна (т.е. последних четырех позиций семян), что выявлено окрашиванием анилиновым синим. ( c ) In vivo скорость роста пыльцевых трубок WT и aca9 пыльцевых трубок, что выявлено окрашиванием анилиновым синим.( d ) Примеры пыльцевых трубок aca9 , в которых оплодотворение было успешным (F, эмбрион вырос) или заблокированным (B, эмбрион не изменился). Стрелки указывают на кончик пыльцевой трубки внутри семяпочки. События были подсчитаны только в верхней половине пестика, где мы ранее определили, что мутантная пыльца была способна к почти нормальному потенциалу роста. ( Правый ) Процент заблокированных событий оплодотворения составил> 50% в этом регионе. ( e ) Примеры прерывания выделения из пыльцевой трубки (Выделение -) по сравнению с успешными реакциями оплодотворения (Выделение +).Показаны изображения с помощью дифференциального интерференционного контраста (ДИК) семяпочек, наложенных на флуоресцентные изображения пыльцевых трубок от растений aca9 (- / -), трансформированных конструкцией ACA9-промотор :: GFP . Фракцию пыльцевых трубок, показывающих успешный выброс в синергидную клетку (стрелка), оценивали по высвобождению цитозольного GFP в большую площадь, занимаемую синергидом, как ранее было установлено Faure et al . (47). ( слева, ) Обобщена фракция пыльцевых трубок, показывающих успешный выброс в синергидную клетку у растений WT и aca9 (- / -).

Во-вторых, мутантная пыльца также показала высокую частоту прерванного оплодотворения. Этот результат был впервые обнаружен при окрашивании созревающих кремнеземов анилиновым синим (рис. 2 d ). В случаях, когда окрашивание показало, что пыльцевая трубка достигла семяпочки, более 50% семяпочек не смогли развить эмбрион. Поскольку дефект aca9 , по-видимому, ограничен мужским гаметофитом, мы интерпретировали это прерванное развитие как неспособность завершить оплодотворение.

Дефект оплодотворения был подтвержден микроскопическим исследованием взаимодействий между пыльцевыми трубками и зародышем-мешком, что отслеживалось по доставке GFP из пыльцевых трубок в синергиды (рис. 2 и ). ). Синергидная клетка представляет собой точку первоначального межклеточного контакта мужского и женского гаметофита. При контакте пыльцевые трубки выпускают свои сперматозоиды в синергид (менее чем за минуту) (33, 34). В отличие от оплодотворения WT,> 50% мутантной пыльцы не выделяют сперматозоиды, несмотря на то, что они достигли зародышевого мешка.Эта частота абортов> 50% коррелировала с частотой, наблюдаемой при использовании анилинового синего (рис. 2 d ).

Прогноз, который возникает из-за высокой частоты прерванного оплодотворения, состоит в том, что гетерозиготный мутант aca9 , подвергающийся самооплодотворению, должен иметь пониженный набор семян в результате мутантной пыльцы, блокирующей потенциал пыльцы WT для оплодотворения доступных семяпочек (35). В соответствии с этим ожиданием, гетерозиготные растения демонстрируют полудоминантный фенотип с 25% сокращением завязки семян (в Сан-Диего, 35.7 ± 2,9 семян на стручок, n = 290 стручков). Таким образом, несмотря на сниженный потенциал роста, пыльца aca9 по-прежнему эффективно конкурирует с пыльцой WT в росте и обнаружении семяпочек, по крайней мере, в половине пестика на конце рыльца.

ACA9 специфически экспрессируется в пыльце. Для определения характера экспрессии, ожидаемого для белка ACA9, фрагмент ДНК, соответствующий 1171 п.н. выше стартового кодона ACA9 , был слит с репортерным геном β — глюкуронидазы ( GUS ) и трансформирован в растения Arabidopsis .Экспрессия GUS наблюдалась в основном в пыльце (рис. 3 a и b ). Экспрессия инициировалась между стадиями цветков с 12а по 14 [стадии, определенные Smyth et al . (36)]. Не было доказательств экспрессии GUS в пестике (включая семяпочки и передающий тракт) до опыления.

ACA9 предпочтительно экспрессируется в пыльце. Показано окрашивание X-Gluc, показывающее экспрессию слияния ACA9-промотора :: GUS в пыльниках цветков ( a ) и изолированной пыльце ( b ). Гистохимический анализ активности GUS проводили, как описано Jefferson et al . (48). Такая же картина окрашивания наблюдалась в поколении Т ₂ шести независимых трансгенных линий.(c ) ПЦР-анализ в реальном времени экспрессии ACA9 в тканях WT Arabidopsis . Значения представляют собой нормированное среднее трех экспериментов ± стандартная ошибка среднего.

Для подтверждения результатов GUS-репортера, образец экспрессии мРНК ACA9 оценивали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием праймеров, специфичных для ACA9 . мРНК ACA9 была обнаружена в основном в тычинках (рис. 3 c ), на уровне> 500 раз выше, чем у пестиков.Низкий уровень экспрессии, обнаруженный в пестиках, вероятно, связан с загрязнением пыльцы. Этот результат RT-PCR подтверждает анализ репортера GUS, указывающий, что ACA9 экспрессируется в мужском гаметофите, но не в женском гаметофите. Наконец, общедоступный анализ профиля экспрессии пыльцы на основе олигонуклеотидов (Affy GeneChip) (http://ssbdjc2.nottingham.ac.uk/narrays/experimentbrowse.pl) показал, что ACA9 был наиболее экспрессируемым из всех ACA. в зрелой пыльце, включая гены известных и ожидаемых насосов Ca ²⁺ плазматической мембраны, таких как ACA8 и ACA10 (e.g., экспрессия ACA9 в 20 раз превышала экспрессию ACA8 ) (34). Значительная экспрессия ACA9 наблюдалась, начиная со стадии трехклеточной пыльцы.

Субклеточная локализация ACA9. Чтобы определить потенциал субклеточного нацеливания ACA9, ACA9-YFP экспрессировали в стабильных трансгенных растениях Arabidopsis под контролем промотора ACA9 . В качестве контроля репортер GFP экспрессировался параллельно под одним и тем же промотором.Пыльцу трансгенных растений проращивали на затвердевшей агаровой среде и исследовали с помощью конфокальной микроскопии (рис. 4). В соответствии с расположением плазматической мембраны слитый белок ACA9-YFP всегда наблюдался по периметру пыльцевой трубки. Такой же паттерн локализации наблюдали у нескольких трансгенных линий, включая те, которые демонстрируют яркие или едва выявляемые уровни экспрессии. Напротив, контроли GFP всегда демонстрировали сильную флуоресценцию, рассеянную по всему телу клетки. Поскольку слияние ACA9-YFP было способно дополнить мутант aca9 , мы пришли к выводу, что по крайней мере подмножество белка ACA9-YFP было локализовано в функционально подходящем месте, предположительно плазматической мембране.

Конфокальная флуоресцентная микроскопия, показывающая локализацию на плазматической мембране YFP-меченного ACA9, экспрессированного в пыльцевых пробирках. Растения трансформировали конструкциями, содержащими промотор ACA9, конструкция :: GFP (GFP) или промотор ACA9 :: ACA9 :: YFP (ACA9-YFP).

Независимая линия доказательств в поддержку функции плазматической мембраны для ACA9 была получена путем демонстрации того, что изоформа ACA8 может также дополнять мутант aca9 . ACA8 представляет собой хорошо охарактеризованную Ca ²⁺ -АТФазу плазматической мембраны (23) в том же подсемействе ACA, что и ACA9. ACA8 был слит с GFP и экспрессировался под промотором ACA9 . У трансгенных растений второго поколения комплементация наблюдалась как 2-кратное (или более) увеличение набора семян во всех 10 независимых трансгенных линиях (средний набор семян на стручок = 25.8).

ACA9 действует как насос Ca ²⁺ в дрожжевом штамме K616. Хотя ACA9 тесно связан с хорошо охарактеризованными насосами Ca ²⁺ (21, 22), мы подтвердили насосную функцию Ca ²⁺ для ACA9 путем комплементации штамма дрожжей K616, который содержит делецию собственного Ca ^{2 +} насосы, PMR1 и PMC1 (Рис. 5 b ). Экспрессия ACA9ΔN (ACA9, сконструированная с N-концевым усечением) позволяла штамму K616 расти на среде, обедненной Ca ²⁺ .Клетки K616 обычно не могут расти на среде, обедненной Ca ²⁺ . Для комплементации требуется функциональная насосная активность Ca ²⁺ , чтобы секреторный путь убирал достаточно Ca ²⁺ из цитозоля для правильного функционирования. Однако, поскольку ACA9 представляет собой плазматический мембранный насос, его способность дополнять K616, по-видимому, является результатом либо ( i ) временной активности при его прохождении через секреторный путь дрожжей, либо ( ii ) неправильного накопления растительного насоса в дрожжах. эндоплазматический ретикулум, аналогичный тому, который наблюдается для тесно связанного с плазматической мембраной кальциевого насоса ACA8 (37).В любом случае комплементация обеспечивает генетическое доказательство того, что ACA9 может функционировать как высокоаффинный насос Ca ²⁺ .

N-конец At-ACA9 связывает кальмодулин, а усеченная на N-конце версия ACA9 дополняет дрожжевой мутант, лишенный насосов Ca ²⁺ .( a ) Анализ наложения, показывающий кальций-зависимое связывание кальмодулина с N-концевым фрагментом At-ACA9. Связывание CaM наблюдали с 1 мМ Ca ²⁺ , тогда как связывание отменялось в присутствии 5 мМ EGTA. Сам по себе GST не связывал CaM ни в присутствии, ни в отсутствие Ca ²⁺ (результаты не показаны). ( b ) Штамм дрожжей K616, лишенный эндогенного Ca ²⁺ насосов, трансформированных пустым вектором (pYES2), полноразмерным ACA9 или N-концевой усеченной версией ACA9 (ACA9ΔN), выращивали на среде с 10 мМ CaCl ₂ или 10 мМ EGTA, а также с глюкозой (glu) или галактозой (gal).Экспрессия генов ACA9 регулировалась индуцируемым галактозой промотором GAL1 . K616, трансформированный пустым вектором (pYES2), использовали в качестве контроля.

Важно отметить, что ACA9-комплементация дрожжевого K616 наблюдалась только при использовании дерегулируемого насоса, созданного удалением 93 остатков N-концевого домена, который несет предсказанный регулируемый кальмодулином аутоингибитор. Этот результат согласуется с данными о других АТФазах P _2B , которые также активируются только при удалении аутоингибитора (21, 22).Чтобы убедиться, что N-концевой регуляторный домен ACA9 содержит ожидаемый сайт связывания кальмодулина, область Met-40 — Ala-95 ACA9 была экспрессирована как слитый белок GST. В тесте наложения кальмодулина (рис. 5 a ), слитый белок связывал кальмодулин зависимым от Ca ²⁺ образом. Таким образом, исследования комплементации дрожжей и связывания кальмодулина подтверждают ожидание, что ACA9 является кальциевым насосом, активируемым кальмодулином, подобным другим АТФазам P _2B , полученным из растений.

Обсуждение

Доказательства, представленные здесь, показывают, что плохой набор семян в нокаут-мутанте aca9 является результатом частичной мужской стерильности (рис. 1). Эта частичная мужская стерильность, по-видимому, имеет по крайней мере две основные причины, включая сниженный потенциал роста мутантной пыльцы и высокую частоту прерванного оплодотворения в точке, где пыльцевые трубки достигают зародышевого мешка (рис. 2). Поскольку ACA9 функционирует как насос плазматической мембраны Ca ²⁺ (рис.4 и 5), предполагается, что причиной этих дефектов пыльцы являются изменения в передаче сигналов или питании Ca ²⁺ . Идентификация мутантов aca9 с нарушением пыльцевого насоса Ca ²⁺ должна предоставить полезный генетический инструмент для выяснения роли динамики Ca ²⁺ в росте и развитии пыльцевых трубок.

Значительное внимание уделяется потенциальной роли Ca ²⁺ в пыльце. Например, колеблющийся градиент Ca ²⁺ с фокусировкой на кончике в растущих пыльцевых трубках был зарегистрирован с использованием флуоресцентных и люминесцентных индикаторов Ca ²⁺ (9–11, 13, 38, 39).Градиент Ca ²⁺ обычно наблюдается только в растущих пыльцевых трубках, и манипулирование внеклеточными и внутриклеточными концентрациями Ca ²⁺ с помощью хелаторов и фармакологических агентов коррелирует с ингибированием роста (40–42). Однако, несмотря на огромное количество доказательств, указывающих на связь между динамикой Ca ²⁺ и ростом пыльцевых трубок, наши результаты по ACA9 предоставляют генетические доказательства в поддержку модели, в которой сигналы Ca ²⁺ являются естественными регуляторами роста пыльцевых трубок и оплодотворение.

В то время как современные модели роста кончиков пыльцы и оплодотворения уже включают каналы притока Ca ²⁺ на плазматической мембране, они не включают специфическую функцию для оттока насоса Ca ²⁺ плазматической мембраны. Представленные здесь данные показывают, что более полная модель должна включать насос Ca ²⁺ (например, ACA9) в качестве необходимого пути оттока через плазматическую мембрану. Таким образом, мы предлагаем две модели для рассмотрения функции ACA9 в плазматической мембране пыльцевой трубки.Во-первых, ACA9 может обеспечивать механизм регуляции цитозольного гомеостаза Ca ²⁺ , тем самым предотвращая накопление цитотоксических уровней Ca ²⁺ . Хотя мы не можем исключить эту модель «гомеостаза», мы считаем ее маловероятной, поскольку исследования профилей экспрессии предоставили доказательства того, что пыльца может экспрессировать другие переносчики оттока Ca ²⁺ (43), которые в отсутствие ACA9 должны быть способны регулировать Ca ²⁺ гомеостаз. Кроме того, дрожжи, по-видимому, регулируют цитозольные уровни Ca ²⁺ без какого-либо локализованного в плазматической мембране насоса Ca ²⁺ (30).Таким образом, нет прецедентов, чтобы ожидать, что насос плазматической мембраны Ca ²⁺ будет функционировать в качестве главного регулятора гомеостаза Ca ²⁺ .

Следовательно, мы предпочитаем вторую модель, в которой ACA9 является частью осциллятора Ca ²⁺ , который функционирует в передаче сигналов Ca ²⁺ на плазматической мембране (44). В этой модели ACA9 обеспечивает регулируемый путь оттока, который рециркулирует Ca ²⁺ , который входит через канал плазматической мембраны, обратно в точку его происхождения, тем самым запуская систему для нового спайка Ca ²⁺ .Дефект в осцилляторе плазматической мембраны может нарушить множественные сигнальные пути, которые берут начало на плазматической мембране, включая сигналы, которые с обратной связью регулируют колебательное поведение локализованного на кончике градиента Ca ²⁺ во время роста кончика пыльцы. Таким образом, нарушение компонента оттока плазматической мембраны осциллятора Ca ²⁺ может легко привести как к более медленному росту кончика, так и к нарушению сигнальных взаимодействий с зародышевым мешком, как описано здесь для мутантов aca9 .

Особенностью фенотипа aca9 является очевидная блокировка оплодотворения в точке физического взаимодействия между пыльцевой трубкой и зародышевым мешком / синергидом. В настоящее время наиболее хорошо охарактеризованные мутации, которые нарушают этот критический аспект оплодотворения, соответствуют функциям генов, экспрессируемых в женском гаметофите [например, сирена / ферония (34, 45)], а не в мужском гаметофите (например, как aca9 ). Мутанты сирена и ферония влияют на женские гаметофитные функции, которые каким-то образом предотвращают разрыв пыльцевых трубок при проникновении синергида (т.е.е., нет выделения сперматозоидов). Этот результат может быть связан с потерей сигнала, производимого женским гаметофитом, скорее всего, от самой синергидной клетки (33). Напротив, мутация aca9 приводит к дефициту в мужском гаметофите и потенциально представляет собой дефект в декодировании или действии на сигнал, исходящий от женского гаметофита. Хотя сирена / feronia и aca9 все показывают дефект в выделении спермы, пыльцевые трубки мутанта sirene / feronia продолжают расти в синергид, тогда как пыльцевые трубки aca9 соответствующим образом реагируют на пыльцевые трубки. сигнал, останавливающий дальнейший рост.Таким образом, aca9 и сирена / feronia демонстрируют явно разные фенотипы на клеточном уровне.

В заключение, генетические данные идентифицируют ACA9 как переносчик Ca ²⁺ , который функционирует в мужском гаметофите для нормального роста пыльцевой трубки и взаимодействия между пыльцевой трубкой и зародышевым мешком. Это открытие представляет собой пример фенотипа потери функции для насоса Ca ²⁺ ACA-типа у растений. Таким образом, aca9 / ACA9 обеспечивает парадигму для изучения структуры и функции всех 10 членов этого семейства генов в Arabidopsis , а также регулируемых кальмодулином насосов Ca ²⁺ в нерастительных системах.Например, насос Ca ²⁺ плазматической мембраны участвует в жизнеспособности сперматозоидов млекопитающих (7, 46), животного аналога мужского гаметофита у растений. Таким образом, наши результаты предоставляют генетический инструмент для начала анализа роли кальмодулин-регулируемых насосов Ca ²⁺ у растений и животных.

Благодарности

Помощь с конфокальной микроскопией была предоставлена ​​Малкольмом Вудом. Особая благодарность Кэти Труонг, Читлали Вильялобос и Грете Гранштедт за техническую помощь.Эта работа была поддержана грантами организации Human Frontier Science Program (MGP и JFH), Рамочной программы 5 Европейского союза (MGP), Датского совета сельскохозяйственных и ветеринарных исследований (MGP) и Министерства энергетики (DE). -FG03-94ER20152) и Национальные институты здравоохранения (JFH).

Сноски

• ↵ ¶ Кому должна быть адресована корреспонденция.Эл. Почта: palmgren {at} biobase.dk.

• ↵ † РС. и С.М.Р. внес равный вклад в эту работу.

• Этот документ был отправлен непосредственно (Трек II) в офис PNAS.

• Сокращения: PMCA, плазматическая мембрана Ca ²⁺ АТФаза; АСА, аутоингибированная Са ²⁺ АТФаза; Т-ДНК, часть плазмиды Ti (индуцирующей опухоль), которая переносится в клетки растений; YFP, белок желтой флуоресценции; GUS, β — глюкуронидаза.

• Авторские права © 2004, Национальная академия наук

Происхождение, роль и судьба органических кислот в почвах: обзор

Открытый архив в сотрудничестве с SAAB

Открытый архив

Основные моменты

•

Источники из почвенных органических кислот — растения, микробы и растительный мусор.

•

На динамику и роль органических кислот влияют их типы и количества.

•

В большинстве исследований органических кислот почвы недооценивается их количество.

•

Сорбция и разложение вносят значительный вклад в общее содержание органических кислот в почве.

Abstract

Появляется все больше свидетельств того, что происхождение органических кислот (OAs) так же важно, как их роль и пути производства. Этот обзор сфокусирован на информации о проблемах, связанных с различными аспектами производства и выброса ОА в почву, с основной целью согласования различных взглядов для лучшего понимания этой темы.

Значительный объем работ, посвященных пониманию происхождения, роли и динамики OA в почве, был подвергнут критическому анализу с точки зрения их различных позиций в этом обзоре. Органические кислоты в почве происходят из различных источников, включая корни растений, микроорганизмы и органическое разложение. Хотя синтез ОА в почвенной среде может отражать естественную реакцию биологических систем на биотические и абиотические стрессы, они также играют решающую роль в физико-химических процессах, таких как минерализация и солюбилизация труднодоступных и сложных минералов, а также вносят вклад в углеродный цикл и детоксикацию. металлов.Однако эти роли, вероятно, являются совокупным эффектом почвенных OA, взаимодействующих с другими факторами (типом почвы, pH почвы, микробами и другими метаболитами). Основная проблема в выяснении и разгадывании динамики OA в почве заключается в способности объяснить и понять, как OA высвобождаются в ризосфере вместе с другими важными метаболитами, которые, возможно, влияют на динамику.

Сокращения

низкомолекулярная органическая кислота

высокомолекулярная органическая кислота

Пиролизная ионизационная масс-спектрометрия

Ключевые слова

Ризосфера

0003 Mobilic

Mobilic

Солюбилизация

Сорбция

Минерализация

Низкомолекулярная органическая кислота

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2016 SAAB.Опубликовано Elsevier B.V.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Сперматозоиды являются пассивным грузом пыльцевой трубки при оплодотворении растений

Производительность фотосинтеза и фертильность подавляются в антисмысловой сои GmAOX2b

• © 2010 Американское общество биологов растений

Abstract

Альтернативная оксидаза (AOX) — это цианид-резистентная оксидаза, которая обеспечивает альтернативный выход электронов из дыхательная электронная транспортная цепь встроена во внутреннюю мембрану митохондрий растений.Исследование растений сои ( Glycine max ), несущих антисмысловой ген GmAOX2b , показало, что АО играет центральную роль в репродуктивном развитии и плодовитости. В трех независимо трансформированных антисмысловых линиях набор семян был уменьшен на 16–43%, тогда как выкидыш семязачатка увеличился в 1,2–1,7 раза по сравнению с контрольными растениями с нетрансгенной трансформацией. Снижение плодовитости было связано со снижением цианисто-устойчивого цельного листа, чувствительного к салицилгидроксамовой кислоте дыхания и чистого фотосинтеза, но не было изменений общего дыхания в темноте.Частота возможных событий оплодотворения была снижена по крайней мере на одну треть у антисмысловых растений как вероятное следствие дефектов предпочтительности. Пестики антисмысловых растений содержали более высокую долю незрелых, неплодородных зародышевых мешочков по сравнению с нетрансгенными контрольными растениями. Увеличение частоты прерывания пыльцы in vivo и снижение скорости прорастания пыльцы in vitro предполагает, что антисмысловой ген нарушает развитие и функцию пыльцы. Взаимные скрещивания между антисмысловыми и нетрансгенными растениями показали, что пыльца, продуцируемая антисмысловыми растениями, менее активна в оплодотворении.Взятые вместе, представленные здесь результаты показывают, что экспрессия АО играет важную роль в определении нормального развития и функции гаметофитов.

Электронная транспортная система, встроенная во внутреннюю митохондриальную мембрану растения, содержит две терминальные оксидазы, цитохромоксидазу и альтернативную оксидазу (АОХ). АОХ — устойчивый к цианидам фермент, который обеспечивает альтернативную точку выхода для электронов, попадающих в дыхательные пути. Электроны, которые выходят из пула убихинола через АО, обходят переносящие протоны дыхательные комплексы III и IV, внося меньший вклад в формирование электрохимического протонного градиента через внутреннюю митохондриальную мембрану, чем электроны, проходящие по пути цитохрома.Следовательно, производство АТФ по сравнению с потреблением кислорода ниже для альтернативного пути, чем для цитохромного пути (Finnegan et al., 2004).

Основная роль АОХ в растениях, по-видимому, заключается в предотвращении окислительного стресса путем поддержания низкого уровня восстановления пула убихинона дыхательной цепи (Maxwell et al., 1999), а экспрессия гена АОХ сильно индуцируется большинство стрессовых условий (Clifton et al., 2005). Переменное вовлечение AOX также может способствовать поддержанию постоянного энергетического заряда клеток, позволяя растениям поддерживать стабильные темпы роста в меняющихся условиях окружающей среды (Hansen et al., 2002; Мур и др., 2002). АОХ, вероятно, обеспечивает продолжение цикла трикарбоновой кислоты (ТСА), когда активность цитохромного пути ограничена высоким зарядом клеточной энергии или низкой доступностью АДФ (Lambers, 1985; Wagner and Krab, 1995). Таким образом, АО может помочь органам растений приспособиться к запрограммированным в процессе развития изменениям потребности в энергии и биосинтетическим потребностям (Lennon et al., 1995; McCabe et al., 1998; Millar et al., 1998). АОХ может помочь оптимизировать фотосинтез за счет рассеивания избыточного восстановителя, образующегося в хлоропластах, защищая фотосинтетический аппарат от фотоингибирования (Yoshida et al., 2006).

Выработка тепла, опосредованная AOX, имеет решающее значение для биологии опыления термогенных видов. Термогенез был предложен для облегчения испарения ароматических соединений для привлечения опылителей (Meeuse and Raskin, 1988) и / или для обеспечения оптимальной температуры для развития цветков (Seymour and Schultze-Motel, 1998). Недавно было предложено термогенез для предотвращения низкотемпературного повреждения развивающейся пыльцы (Onda et al., 2008) и для оптимизации прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок у скунсовой капусты ( Symplocarpus renifolius ), обеспечивая успешное оплодотворение ранней весной (Seymour et al. al., 2009).

Роль АО в воспроизводстве нетермогенных растений неясна. Тканевая и стадийная продукция AOX в пыльниках Phaseolus vulgaris предполагает, что AOX важен для воспроизводства растений, особенно во время микроспорогенеза и микрогаметогенеза (Johns et al., 1993). Сильная продукция AOX в тапетуме и развивающиеся микроспоры фертильной линии петунии ( Petunia hybrida ), но не в цитоплазматической линии с мужской стерильностью (Conley and Hanson, 1994), и увеличение аборта пыльцы в AOX-антисмысловом (AS) табаке. ( Nicotiana tabacum ; Kitashiba et al., 1999) предполагают участие АО в развитии пыльцы. Разделение AOX потока углерода через цикл TCA от контроля аденилата (Palmer, 1976; Day et al., 1995) может быть важным для поддержания биосинтеза в тапетуме и спорогенных тканях во время образования пыльцы (Conley and Hanson, 1995). Недавно транскрипты AtAOX1a и AtAOX1b были обнаружены в пыльце Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) после прорастания и удлинения трубки (Wang et al., 2008), предполагая, что АО может играть роль в росте пыльцевых трубок.

Женский гаметофит, или зародышевый мешок, имеет решающее значение для большинства фаз полового размножения растений, от управления пыльцевыми трубками до инициации развития зародыша и семян (Yadegari and Drews, 2004). Экспрессия репортерного гена GUS, управляемого промотором GmAOX1 во всем плодолистике и промотором GmAOX2b в стигме Arabidopsis, предполагает, что AOX также может играть роль в развитии или функции женских репродуктивных тканей (Thirkettle -Watts et al., 2003). Недавнее сравнение профилей транскриптов пестиков дикого типа и мутантных пестиков, лишенных зародышевого мешка, показало, что AtAOX1a был геном, экспрессируемым в зародышевом мешке (Johnston et al., 2007), что дало дополнительные косвенные доказательства того, что АО может быть вовлечено в эмбриональный мешок. развитие и / или функция мешка.

У растений AOX кодируется небольшим семейством генов, члены которого могут быть разделены на две группы, AOX1 и AOX2, на основе идентичности аминокислотной последовательности (Considine et al., 2002).Некоторые виды подверглись пролиферации генов типа AOX1, а другие — нет. Арабидопсис, например, имеет четыре гена типа AOX1 и один ген типа AOX2, тогда как соя ( Glycine max ) имеет только один ген типа AOX1 и два гена типа AOX2, GmAOX2a и GmAOX2b (Whelan et al. al., 1996; Finnegan et al., 1997; Considine et al., 2002). До сих пор не наблюдалось биохимических различий для изоформ, кодируемых двумя типами генов. Однако обычно это ген типа AOX1, который индуцируется стрессом в тех растениях, где была идентифицирована индуцированная изоформа AOX.В сое экспрессия белков GmAOX2a и GmAOX2b по-разному регулируется в зависимости от развития и ткани. GmAOX2a обнаруживается преимущественно в зеленых семядолях и листьях, тогда как GmAOX2b встречается в корнях, семядолях и листьях (Finnegan et al., 1997; McCabe et al., 1998; Djajanegara et al., 2002). Чтобы дать нам лучшую возможность получить представление о роли АОХ в отношении всего растения, мы подавили экспрессию GmAOX2b, наиболее широко распространенной и распространенной формы АО в сое.Было обнаружено, что АО является важным детерминантом плодовитости растений как на уровне мужских, так и женских гаметофитов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия белка AOX листа была репрессирована в

Три независимых трансгенных объекта сои были восстановлены после введения полноразмерной кДНК GmAOX2b в ориентации AS под контролем промотора 35S. Линии, полученные от первичных трансформантов, были названы 3B10, 6C2 и 6C5.Для восстановления гомозиготных особей каждый первичный трансформант размножали путем самоопыления. Для линии 3B10 гомозиготный индивид был идентифицирован в поколении Т3 с помощью ПЦР (данные не показаны). Для линий 6C2 и 6C5 стойкая неменделевская сегрегация трансгена произошла в поколении T6 (данные не показаны), и гомозиготные растения AS не были восстановлены. Растения, используемые в качестве контроля в следующих экспериментах, представляли собой нетрансгенные сегреганты, выделенные из каждой трансформированной линии. Отсутствие трансгена AS подтверждено ПЦР.Растения AS были несколько короче и имели меньшую площадь зеленых листьев по сравнению с нетрансгенными контролями, но количество цветков и время цветения не изменились. Подробный анализ роста растений будет представлен в другом месте (Т.-Т. Чай, Т.Д. Колмер и П.М. Финнеган, неопубликованные данные).

Влияние трансгена на содержание белка АОХ в зеленых листьях определяли для линий, трансформированных AS. В каждом из 66 исследованных растений AS поколения Т3 иммунореактивные белки были обнаружены при 34 и 36 кДа (рис.1), что соответствует белкам сои GmAOX2a и GmAOX2b соответственно (Finnegan et al., 1997). Продукт стресс-индуцируемого гена GmAOX1 (Tanudji et al., 1999) у этих растений не обнаружен. Ни у одного растения не было обнаружено полного отсутствия белка GmAOX2b или GmAOX2a в листьях. Порин, белок внешней митохондриальной мембраны, также был обнаружен и использован в качестве контроля нагрузки для общего митохондриального белка (Ribas-Carbo et al., 2005). Показаны репрезентативные иммуноблоты для четырех растений AS и четырех контрольных растений (рис.1).

Обнаружение иммуноблотом белков GmAOX и порина в неочищенных препаратах мембран из самых молодых полностью разросшихся листьев нетрансгенных (N) и GmAOX2b AS (AS) братьев и сестер линии 6C5. Иммунодетекция и денситометрия выполнялись, как описано в разделе «Материалы и методы». Неочищенные мембранные препараты подвергали иммуноблоттингу в двух экземплярах и зондировали либо анти-AOX, либо анти-пориновым антителом. Слева показаны размеры обнаруженных белков. Цифры под панелями представляют собой отношения сигналов общего GmAOX2 (GmAOX2b + GmAOX2a) к порину, рассчитанные из интенсивностей соответствующих полос.

Отношения сигналов GmAOX2b к порину использовали для сравнения относительной численности GmAOX2b между нетрансгенными и AS растениями (рис. 2A). В пределах каждой линии индивидуальное нетрансгенное контрольное растение, дающее наибольший сигнал от белка GmAOX2b 36 кДа, оценивалось как 100%. Сигнал GmAOX2b от всех других растений в линии сравнивался с этим эталоном. Используя этот подход, содержание белка GmAOX2b относительно порина в листьях нетрансгенной сои варьировалось более чем на 1.5-ти кратный диапазон. Среднее значение для трех наборов контрольных растений составляло от 77% до 91% от контрольного значения для соответствующей линии (рис. 2А). У растений AS среднее содержание GmAOX2b составляло от 53% до 70% от контрольного значения для линии. Средние значения для контрольных растений и растений AS существенно не различались на основании теста Mann-Whitney U . Однако разброс среди растений AS был намного больше, чем в контроле. В каждой линии подмножество растений AS имело обилие GmAOX2b, которое находилось в пределах диапазона контрольных растений, что указывает на отсутствие подавления AS у этих особей.Напротив, содержание GmAOX2b в некоторых растениях AS было почти на 65% ниже, чем среднее значение для соответствующих нетрансгенных контролей. В линиях 3B10 и 6C5 примерно у половины растений AS было меньше GmAOX2b, чем у всех контрольных растений (рис. 2A), в то время как в линии 6C2 снижение GmAOX2b было более сильным, при этом 60% растений AS имели меньше этого белка. чем все контрольные растения. Эти результаты, взятые в свете известной вариабельности подавления экспрессии генов АС (Penarrubia et al., 1992; Zhang et al., 1997), предполагают, что ген GmAOX2b AS подавлял экспрессию GmAOX2b очень вариабельным образом.

Относительное содержание GmAOX2b (A), GmAOX2a (B) и GmAOX2b + GmAOX2a (C) в сои GmAOX2b AS. Относительные количества белка AOX2 и порина в самых молодых полностью распустившихся листьях нетрансгенных (N) и GmAOX2b AS (AS) растений определяли, как описано в разделе «Материалы и методы». На графиках прямоугольных усов прямоугольники представляют растения между 25-м и 75-м процентилями, причем усы простираются до крайних значений данных, но исключают выбросы (кружки).Выбросы определяются в статистическом программном пакете R как точки данных, лежащие на расстоянии более чем в 1,5 раза превышающем межквартильный размах ниже 25-го или выше 75-го процентиля. Межквартильный размах — это разница между 25-м и 75-м процентилями. Сплошные и пунктирные линии в каждом прямоугольнике обозначают медианное и среднее значения соответственно. Количество проанализированных растений указано в скобках.

Обилие GmAOX2a среди нетрансгенных контрольных растений колебалось от 67% до 79% эталонного, в то время как среднее значение для растений AS колебалось от 62% до 73% эталонного (рис.2Б). Хотя разница в среднем содержании белка GmAOX2a между контрольными растениями и растениями AS не была значительной, 25% растений AS из линий 3B10 и 6C5 и 50% растений AS из линии 6C2 имели меньше белка GmAOX2a, чем все контрольные растения. Этот результат предполагает, что ко-супрессия гена GmAOX2a геном GmAOX2b AS происходит по крайней мере в некоторых отдельных растениях. В целом, общее содержание белка GmAOX2 относительно порина в листьях нетрансгенной сои варьировало в 2 раза, со средним значением от 78% до 80% от эталонного (рис.2С). У растений AS среднее содержание общего GmAOX2 составляло от 59% до 70% от эталонного уровня. Линия 6C2 имела наибольшую долю отдельных растений, показывающих подавление общего белка GmAOX2, поскольку 60% растений AS имели меньше GmAOX2, чем все контрольные растения. Однако наиболее сильно подавленные растения принадлежали к линии 3B10 (рис. 2C).

Определено влияние репрессии АОХ на дыхание. Неожиданно, несмотря на то, что АО является митохондриальным респираторным белком, не было обнаружено значительных различий в скорости дыхания темноты листьев между AS и нетрансгенными контрольными растениями всех трех линий, использующих газообмен (данные не показаны).Общее дыхание листьев также было сходным у контрольных растений и растений AS из гомозиготной линии 3B10 при измерении с использованием кислородного электрода (фиг. 3A). Когда KCN был добавлен в анализ с кислородным электродом, наблюдалось стимулирование поглощения кислорода в тканях контрольного листа, но не в тканях листа AS (фиг. 3B). Когда частота дыхания, чувствительная к KCN-резистентной салицилгидроксамовой кислоте (SHAM), выражалась как процент от общей скорости дыхания, активность альтернативного пути была значительно ниже при AS, чем в тканях контрольных листьев (рис.3С).

Скорость потребления кислорода тканями листа нетрансгенных (N) и GmAOX2b AS (AS) растений линии 3B10. A, общая частота дыхания. B, устойчивость к KCN, чувствительность к SHAM. C, устойчивый к KCN, чувствительный к SHAM частота дыхания, выраженная в процентах от общего дыхания. Общую скорость дыхания определяли путем вычитания скоростей остаточного поглощения кислорода (измеренных в присутствии 2,5 мм KCN и 10 мм SHAM) из исходных скоростей поглощения кислорода (измеренных в отсутствие ингибиторов).Частота дыхания, устойчивого к KCN и чувствительна к SHAM, определялась путем вычитания скорости поглощения остаточного кислорода из скоростей поглощения кислорода, измеренных в присутствии 2,5 мм KCN. Все измерения проводились с использованием полосок листьев, отрезанных от самых молодых полностью распустившихся листьев растений N и AS, как описано в разделе «Материалы и методы». Графики коробчатого уса были такими, как описано в легенде к Фигуре 2, а количество проанализированных растений указано в скобках. Звездочка указывает на группу AS, среднее значение которой значительно отличалось от нетрансгенной группы, как определено с помощью теста Mann-Whitney U .DW, Сухой вес.

Урожайность растений подавлялась в

Физиологическое воздействие репрессии AOX в сое оценивали с использованием газообмена для определения чистого фотосинтеза. Скорость чистого фотосинтеза была снижена до 32% в листьях, прикрепленных к основному стеблю, и до 43% в листьях, прикрепленных к ветвям растений AS из линий 3B10 и 6C2 (рис. 4). В строке 6C5 чистая скорость фотосинтеза подавлялась только в ветвях листьев. При проведении этих измерений было отмечено, что устьичная проводимость (g _s ) имела сильную положительную корреляцию ( r ² = 0.81, P <0,05) с чистым коэффициентом фотосинтеза по трем линиям. Однако, что более важно, внутренняя концентрация CO ₂ (Ci) не различалась между AS и нетрансгенными контрольными растениями в трех линиях, но была постоянной 293 ± 2 мк моль моль ^-1 (данные не показаны). Постоянное значение Ci указывает на то, что наблюдаемые вариации g _s не влияют на скорость доставки субстрата для фотосинтеза. Подавление фотосинтетической активности также сопровождалось соответствующим снижением концентрации фотосинтетических пигментов (данные не показаны).

Чистая скорость ассимиляции CO ₂ в сое GmAOX2b AS. Чистые скорости поглощения CO ₂ самыми молодыми полностью разросшимися листьями на главном стебле (черные полосы) и на ветвях (белые полосы) нетрансгенных (N) и GmAOX2b AS (AS) растений определяли, как описано в « Материалы и методы.» Все растения в линии оценивали в один и тот же день, а каждую линию оценивали в другой день. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка ( n = 10 растений).Звездочки указывают средние значения, которые значительно отличались ( P <0,05) в соответствии с тестом Стьюдента t от соответствующего значения, определенного для нетрансгенных контрольных растений.

Урожайность семян определяли для АС и контрольных растений в поколении Т5. Нетрансгенные контрольные растения имели одинаковые урожаи семян во всех трех линиях. Среднее количество семян, продуцируемых растениями AS всех трех линий, было снижено по сравнению с нетрансгенными контрольными растениями (рис.5). Гомозиготные растения AS из линии 3B10 были наиболее сильно поражены, имея в среднем 43% снижение урожайности семян по сравнению с контролем, при этом все растения давали меньше семян, чем любое из контрольных растений. Гетерозиготные растения AS линий 6C2 и 6C5 имели меньшую депрессию урожая семян. Линия 6C2 пострадала меньше всего: только 25% растений дали меньше семян, чем любое из контрольных растений. У линии 6C2 был больший разброс в урожайности семян по сравнению с линией 6C5, что коррелировало с большим изменением относительного количества белка АОХ в листьях линии 6C2 (рис.2).

Производство семян сои GmAOX2b AS. Подсчитывали семена, полученные от нетрансгенных (N) и GmAOX2b AS (AS) растений из трех трансгенных линий, выращенных, как описано в разделе «Материалы и методы». Цифры в скобках указывают количество растений. Графики прямоугольных усов были такими, как описано в легенде к фиг. 2. Звездочками обозначены группы AS, в которых средние значения значительно отличались от нетрансгенных групп, как определено с помощью теста Mann-Whitney U .

Подсчитывали неразвитые семяпочки, продуцируемые теми же растениями, которые использовались в анализе урожайности семян, чтобы определить, является ли уменьшение набора семян у растений GmAOX2b AS результатом увеличения частоты прерывания беременности семяпочки. Для каждой трансгенной линии было исследовано более 1800 стручков, и не было предпринято никаких попыток определить статус оплодотворения абортированных семяпочек. В трех линиях доля абортированных семяпочек увеличивалась в 1,2-1,7 раза у растений AS по сравнению с нетрансгенными контролями (рис.6). Хотя большая вариабельность снова наблюдалась среди растений 6C2 AS, доля абортов семяпочек в линиях 6C2 и 6C5 в целом была сходной и промежуточной между таковой для линии 3B10 и нетрансгенных контролей.

Аборты семяпочек у сои GmAOX2b AS. Нетрансгенные (N) и GmAOX2b AS (AS) растения сои были такими же, как те, что описаны в легенде к фиг. 5. Графики коробчатого уса были такими, как описано в легенде к фиг. 2. Звездочками обозначены группы AS, где среднее значение значения значительно отличались от нетрансгенных групп, как определено с помощью теста Mann-Whitney U .

Плодородие растений было нарушено в

Растения из трех линий AS были самоопылены вручную, чтобы определить, связано ли уменьшение посевного материала у растений AS с сокращением числа случаев оплодотворения или нарушением условий постоплодотворение. После прорастания пыльцевые трубочки внутри пестика визуализировали путем окрашивания на каллозу, основной углеводный компонент стенок пыльцевых трубок (Li et al., 1999). Возможные события оплодотворения оценивались, когда наблюдалась пыльцевая трубка, которая проникла в семяпочку и вступила в контакт с зародышевым мешком (рис.7А).

Возможное оплодотворение сои GmAOX2b AS. A. Возможные события оплодотворения, когда пыльцевая трубка (PT) проникла в семяпочку (O) через микропиле (M) и вступила в контакт с зародышевым мешком (ES), визуализировали путем окрашивания обесцвеченным анилиновым синим. B — Частота возможных событий оплодотворения, выраженная как доля исследованных семяпочек, через которые была проведена пыльцевая трубка, как в A. Произвольно выбранные цветы из пяти нетрансгенных (N) и пяти GmAOX2b растений AS (AS) из каждой линии опыляли вручную. с собственной пыльцой и проанализировали, как описано в разделе «Материалы и методы.Цифры в скобках указывают количество исследованных семяпочек / количество исследованных яичников. Звездочки указывают группы AS, средние значения которых значительно отличались от нетрансгенных групп, как определено с помощью теста Mann-Whitney U .

Частота возможных событий оплодотворения в цветках растений AS поколения Т6 от всех трех линий была снижена по крайней мере на одну треть по сравнению с нетрансгенными контролями (фиг. 7B). Всего при визуальном осмотре 414 семяпочек из 143 пестиков, опыленных вручную, было обнаружено 165 семяпочек, через которые прошла пыльцевая трубка.В каждую проникающую семяпочку входила только одна пыльцевая трубка, и взаимодействие пыльца-семяпочка выглядело нормальным. Семяпочки, в которые вводили трубку, располагались внутри пестика случайным образом, что указывает на то, что снижение частоты оплодотворения у растений AS не было связано с ограниченным удлинением пыльцевой трубки in vivo. Подтверждение того, что перекрестное опыление не происходило в процессе ручного опыления, и что цветы были отобраны до распада пыльников, было получено при исследовании пестиков 30 неопыленных, но неопыленных цветков (по 10 от каждой линии).У всех отсутствовали пыльцевые зерна на рыльце и рост пыльцевой трубки в яичнике.

При исследовании пестиков цветков, опыленных вручную, были обнаружены два типа семяпочек: содержащие удлиненные зародышевые мешочки зрелого размера (рис. 8A) и содержащие более короткие зародышевые мешочки незрелого размера (рис. 8B). . Семяпочки, содержащие зародышевые мешочки незрелого размера, были на 10-20% меньше, чем семяпочки с зародышевыми мешочками зрелого размера, и располагались в пестиках случайным образом. Маловероятно, что маленькие семяпочки обеспечат продуктивное оплодотворение, так как ни одна из 138 наблюдаемых маленьких семяпочек не прошла через пыльцевую трубку, хотя пыльцевые трубки часто лежали рядом с семяпочкой.Цветки растений AS из линий 3B10 и 6C5 содержали на 30-40% меньше созревших семяпочек, чем нетрансгенные контроли (фиг. 8C). Не было различий в количестве яйцеклеток зрелого размера в линии 6C2, что может до некоторой степени объяснить различия, наблюдаемые в фенотипах между этой линией и другой гетерозиготной линией 6C5. Вряд ли незрелые семяпочки произошли от недозревших цветков. Присутствие по крайней мере некоторых семяпочек, которые привлекли пыльцевые трубки, указывало на то, что цветки созрели и восприимчивы к проникновению пыльцевых трубок (рис.7Б). Кроме того, семяпочки нормального цветка сои достигают зрелости одновременно (Kennell and Horner, 1985).

Наличие семяпочек, содержащих зародышевые мешки зрелого размера в сои GmAOX2b AS. A и B, микрофотографии зародышевых мешочков зрелого (A) и незрелого (B) размера в семязачатках сои. Зрелые плодородные зародышевые мешочки были удлиненными и контактировали с внутренним отверстием микропиле. Bars = 100 мкм м. C. Процент семяпочек от опыленных вручную нетрансгенных (N) цветков и цветков GmAOX2b AS (AS), которые содержали зародышевые мешки зрелого размера.Количество исследованных яичников и семяпочек показано на рисунке 7B.

Способность пыльцы AS прорастать in vitro была протестирована, чтобы определить, вносит ли дефект в мужском гаметофите также вклад в уменьшенное завязывание семян сои GmAOX2b AS. Образец пыльцы, проверенный на прорастание in vitro, впоследствии был окрашен красителем Александра (Alexander, 1969) для определения вероятного статуса жизнеспособности зерен, которые не прорастали. Скорость прорастания пыльцы для нетрансгенных контролей была одинаковой по всем трем линиям, как и доля непроросших пыльцевых зерен, которые были заполнены или прерваны (рис.9). Доля пыльцевых зерен от растений AS поколения Т6 трех линий, прорастающих in vitro, была снижена на 43–50% по сравнению с нетрансгенными контролями. Снижение скорости прорастания пыльцы сопровождалось увеличением доли непроросших пыльцевых зерен, которые были заполнены или прерваны. Частота абортов пыльцы у растений AS трех линий была в 1,6-2,1 раза выше, чем у соответствующих нетрансгенных контрольных растений. Опять же, степень выраженности фенотипа AS была самой низкой в ​​линии 6C2, которая имела самый низкий процент прерванной пыльцы и самый высокий процент заполненной, непророщенной пыльцы линий AS.

Жизнеспособность пыльцы сои GmAOX2b AS. Доли пыльцевых зерен, которые проросли (черные столбцы), которые были заполнены, но не прорастали (белые столбцы) или которые были прерваны (серые столбцы), были определены для нетрансгенных (N) и GmAOX2b AS (AS) растений в три линии GmAOX2b AS. По меньшей мере 2500 пыльцевых зерен, отобранных из 10 случайно выбранных полностью раскрытых цветков на одно растение, культивировали in vitro и окрашивали, как описано в разделе «Материалы и методы».Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка ( n = 5 растений). Звездочки указывают на группы AS, которые значительно отличались ( P <0,05) от соответствующей нетрансгенной группы, как определено с помощью теста Стьюдента t .

Взаимодействия между GmAOX2b AS и контрольными гаметами тестировали in vivo при реципрокных скрещиваниях с использованием цветков растений поколения Т6. Для простоты интерпретации использовали только гомозиготную линию AS 3B10, поскольку каждая произведенная гамета будет нести аллель GmAOX2b AS.После ручного опыления пыльцевые трубки, которые проникают в семяпочки цветка, визуализировали окрашиванием анилиновым синим, чтобы определить частоту возможных событий оплодотворения. Данные были выражены в виде доли зрелых семяпочек, в которые проникли по двум причинам: нетрансгенные и AS растения линии 3B10 различались по количеству образовавшихся зрелых семяпочек (рис. 8), и, вероятно, оплодотворялись только зрелые семяпочки. Нетрансгенная пыльца одинаково успешно проникала в зрелые семяпочки как из AS, так и из нетрансгенных растений, при этом в каждом случае проникало около 70% зрелых семяпочек (Таблица I).Напротив, пыльца AS была способна проникать менее чем в 50% исследованных зрелых семяпочек, независимо от того, была ли восприимчивая самка из AS или нетрансгенного растения. Зрелые семяпочки AS были так же восприимчивы к пыльце, как и их нетрансгенные аналоги. Эффективность процедуры ручного опыления при создании этих скрещиваний была подтверждена отсутствием пыльцы и пыльцевых трубок от 20 выхолощенных цветов, которые не были опылены.

Ручное опыление проводили на линии 3B10 AS и контрольных растениях, как описано в разделе «Материалы и методы.Для каждого скрещивания цветы были случайным образом выбраны из пяти нетрансгенных растений и пяти растений AS.

ОБСУЖДЕНИЕ

Фенотипы дефектной пыльцы и семяпочек у сои GmAOX2b AS продемонстрировали, что экспрессия АО важна для развития и функционирования гаметофитов. Снижение частоты случаев оплодотворения у растений AS показало, что потенциальный набор семян был нарушен еще до стадии оплодотворения. Примечательно, что развитие и функция как мужских, так и женских гаметофитов были нарушены у растений AS.Следовательно, снижение эффективности удобрения и, как следствие, снижение плодовитости сои GmAOX2b AS можно отнести к дефектам предпочтения.

Нарушение функции митохондрий у растений часто приводит к проблемам с мужской фертильностью, о чем свидетельствуют многочисленные примеры, когда мутации митохондриального генома вызывают цитоплазматическую мужскую стерильность и связанные с этим аномалии мужских органов и пыльцы (Linke and Borner, 2005). Однако наши наблюдения дефектов мужских и женских гаметофитов у сои GmAOX2b AS согласуются с появляющимися доказательствами того, что нарушения митохондриальной функции могут нарушать формирование и развитие женских, а также мужских гаметофитов.У Arabidopsis нарушение гена SDh2-1 , который кодирует субъединицу митохондриальной сукцинатдегидрогеназы (респираторный комплекс II), вызвало аберрантный митоз в микроспорах, но также остановило слияние полярных ядер во время развития зародышевого мешка (Leon et al. , 2007). Мутация гена Arabidopsis RPL21M , который кодирует белок L21 митохондриальной 50S-рибосомы, не только увеличивала аборт пыльцы, но также препятствовала нормальному слиянию ядер во время развития зародышевого мешка и во время двойного оплодотворения (Portereiko et al., 2006).

Увеличение развития дефектных мужских гаметофитов у сои AOX AS наблюдалось как увеличение количества абортов пыльцы. Об увеличении доли абортированной пыльцы также сообщалось для мутанта табака AOX AS (Kitashiba et al., 1999). В табаке прерванные зерна пыльцы выглядели сморщенными и сморщенными, и в них отсутствовали зерна крахмала. У сои GmAOX2b AS абортированная пыльца в значительной степени лишена цитоплазмы. Также была более высокая доля необработанной и явно полностью заполненной пыльцы, которая была функционально скомпрометирована, поскольку было явное снижение доли этого класса пыльцы, прорастающей in vitro, а также снижение способности этой пыльцы оплодотворять. in vivo.Репрессия AOX у риса ( Oryza sativa ; K. Toriyama, личное сообщение) и Arabidopsis (Umbach et al., 2005) не вызывала фенотипов фертильности. Хотя AOX может иметь различную роль у этих видов, важно отметить, что все предыдущие исследования были направлены на подавление изоформы типа AOX1. Следовательно, возможно, что в развитии гаметофитов риса и арабидопсиса участвует другой гомолог АОХ, чем тот, который был протестирован. У Arabidopsis это может быть гомолог AOX2-типа, тогда как у риса это обязательно будет другой гомолог AOX1-типа, поскольку рис, по-видимому, не обладает гомологом AOX2-типа.

Нарушенный фенотип пыльцы сои GmAOX2b AS согласуется с предполагаемой ролью АО в микроспорогенезе и микрогаметогенезе (Johns et al., 1993). Мутант Arabidopsis sdh2-1 продуцировал пыльцу с дефектом в плане развития и функции, которая была неспособна передавать мутированный аллель следующему поколению (Leon et al., 2007). Неменделирующее наследование может быть обычным фенотипом респираторных мутаций, которые влияют на продукцию как мужских, так и женских гамет, как это также наблюдалось в линиях 6C2 и 6C5.Аллель AS в линии 3B10 не следует этому неменделевскому типу наследования, но может быть восстановлен в гомозиготном состоянии. Возможно, эффект трансгена, вызванный одним локусом AS в пределах линии 3B10, был недостаточно серьезным, чтобы запустить каскад событий, которые приводят к дефектной пыльце.

Было высказано предположение, что дефект продукции пыльцы, наблюдаемый у инсерционного мутанта Atsdh2-1 , связан с компромиссом в производстве энергии и нарушением подачи углеродного скелета для биосинтеза в развивающихся гаметофитах (Leon et al., 2007). То же самое объяснение не может полностью объяснить дефекты, которые мы наблюдали в сое GmAOX2b AS. Кажется маловероятным, что подавление AOX приведет к снижению энергетического заряда клетки, поскольку AOX не участвует в энергосбережении. Вместо этого снижение активности АО, вероятно, позволит увеличить энергетический заряд клетки, увеличивая вероятность образования вредных активных форм кислорода (АФК). Увеличение продукции ROS может иметь пагубное влияние на образование пыльцы и может лежать в основе фенотипа сои AOX AS.Увеличение заряда клеточной энергии из-за снижения активности АО может привести к ограничению цикла ТСА, ситуации, которую, как полагают, может улучшить АОХ (Palmer, 1976). Результирующее снижение поступления углеродных скелетов для биосинтеза потенциально может происходить как в сое AOX AS, так и в sdh2-1 Arabidopsis , и может быть особенно важным в тканях с высокой скоростью биосинтеза, таких как тапетум и спорогенные ткани (Conley and Hanson , 1995). Возможность того, что эти мутации AOX AS и sdh2-1 проявляют свои фенотипы через общий механизм изменения активности цикла TCA, заслуживает дальнейшего внимания.

Об участии АО в развитии женских гаметофитов свидетельствует повышенная частота зародышевых мешков незрелого размера у растений GmAOX2b AS линий 3B10 и 6C5. Повышенное количество явно неоплодотворенных зародышевых мешков предполагало, что количество потенциальных событий оплодотворения уже было задано на более низком уровне у растений GmAOX2b AS, независимо от уровня жизнеспособности пыльцы. Присутствие зародышевых мешочков незрелого размера внутри более мелких семяпочек может быть другим частым результатом событий, нарушающих функцию митохондрий.Фенотип был подобен раннему нарушению роста семяпочек, наблюдаемому у Arabidopsis с мутацией в гене HUELLENLOS , который кодирует белок L14 митохондриальной рибосомы (Skinner et al., 2001). Мутант Atsdh2-1 Arabidopsis со сниженным митохондриальным респираторным комплексом II также является дефектным в развитии эмбрионального мешка (Leon et al., 2007).

Как и в образовании пыльцы, АО может играть роль в определении фертильности женских гаметофитов, в частности в развитии зародышевого мешка, позволяя круговороту ТСА во время высокого клеточного энергетического статуса и / или ограничивая образование АФК (Finnegan et al., 2004). АОХ может также защищать развивающийся зародышевый мешок от несоответствующего запуска запрограммированной гибели клеток (PCD). Клетки AS табака, лишенные AOX, были более восприимчивы к соединениям, вызывающим гибель клеток, таким как перекись водорода и Cys, чем клетки дикого типа (Robson and Vanlerberghe, 2002; Vanlerberghe et al., 2002). Более того, сверхэкспрессия АО ограничивает развитие гиперчувствительной реакции, формы PCD, в листьях табака (Ordog et al., 2002). Во время развития эмбрионального мешка в семяпочке происходит четыре события PCD.Первое событие начинается после мейотических делений и обеспечивает сохранение только одной мегаспоры. Второе событие PCD вызывает дегенерацию антиподальных клеток в развивающемся эмбриональном мешке. Последние два события PCD происходят до оплодотворения. Одна синергидная клетка подвергается PCD, позволяя получать мужские гаметы, в то время как одновременно PCD направляет дегенерацию окружающих тканей яичника (нуцеллуса), чтобы приспособиться к расширяющемуся эмбриональному мешку (Christensen et al., 1997; Wu and Cheung, 2000).Во время этих событий PCD АО может защищать клетки развивающегося зародышевого мешка от окислительного стресса или сигналов клеточной смерти, производимых в клеточном окружении. Кажется вероятным, что ограничение окислительного повреждения является важным аспектом развития зародышевого мешка, учитывая, что высокие уровни аскорбатпероксидазы были обнаружены в яйцеклетках риса (Uchiumi et al., 2007).

В настоящее время ведется много споров о природе сигнала, который привлекает растущую пыльцевую трубку в микропиле (Higashiyama and Hamamura, 2008).Интересно, что ни одна из маленьких семяпочек, наблюдаемых у сои AOX AS, не проникала через пыльцевую трубку. Интересная возможность состоит в том, что активность АОХ может играть роль в генерации этого сигнала.

Частота дыхания в темноте листьев растений AS не изменилась, независимо от того, измеряли ли они с помощью газообмена или кислородного электрода. Это наблюдение аналогично наблюдению, наблюдаемому в листьях AOX-репрессированного Arabidopsis (Umbach et al., 2005) и в клеточной линии табака с AOX-репрессией (Vanlerberghe et al., 1994). В этом исследовании более низкие скорости дыхания, устойчивые к KCN, в ткани листа AS по сравнению с нетрансгенной тканью листа указывают на более низкий потенциал дыхания AOX у растений AS. Этот результат согласуется с более низкими уровнями содержания белка АОХ у растений AS.

Интересно, что добавление KCN к тестам с кислородным электродом стимулировало захват O ₂ в нетрансгенных тканях листа, что ранее сообщалось на растениях Arabidopsis со сверхэкспрессией AOX (Umbach et al., 2005) и в клеточной линии табака, сверхэкспрессирующей AOX (Vanlerberghe et al., 1994). Одним из объяснений этого может быть то, что KCN-стимулированное поглощение O ₂ происходит в интактных тканях из-за снижения синтеза АТФ после ингибирования дыхания цитохрома (Atkin et al., 2002). Снижение синтеза АТФ привело бы к снижению клеточного отношения АТФ к АДФ, что, в свою очередь, стимулировало бы гликолиз, чтобы увеличить поставку респираторных субстратов в митохондрии. Следовательно, потенциал для дыхательного потока электронов увеличится.Однако повышенный поток электронов может происходить только в том случае, если емкость AOX в ткани высока, как в случае соевых бобов и линий со сверхэкспрессией, и если поглощение O ₂ тканью ограничено субстратом (Atkin et al., 2002).

Производительность фотосинтеза подавлялась в сое с репрессией AOX. В то время как между нетрансгенными и AS растениями имелась разница в g _s , Ci был одинаковым для всех исследованных образцов листьев (данные не показаны). Следовательно, снижение g _s в растениях AS, вероятно, имело второстепенное значение для снижения чистых скоростей ассимиляции CO ₂ (для обзора см. Farquhar and Sharkey, 1982) и может в некоторой степени представлять собой ответ на снижение скорость фотосинтеза (Wong et al., 1979). Таким образом, мы заключаем, что снижение фотосинтетической способности растений AS в первую очередь связано с биохимическими или клеточными ограничениями. Такое ограничение, по-видимому, возникло из-за подавления экспрессии белка АОХ. Неясно, оказывает ли репрессия АО прямое или косвенное влияние на фотосинтез, возможно, через снижение концентрации фотосинтетических пигментов. Ингибирование AOX также привело к снижению скорости фотосинтеза в листьях бобов ( Vicia faba ) и привело к чрезмерному восстановлению цепи транспорта электронов фотосинтеза даже в условиях низкой освещенности (Yoshida et al., 2006).

Снижение фотосинтетической способности может указывать на снижение поступления ассимилятов во время репродуктивного роста растений AS. Таким образом, возможно, что на наблюдаемое снижение завязки семян у растений AS также повлияло снижение доступности ассимилятов во время репродуктивного развития. Известно, что соя регулирует размер своего репродуктивного стока в ответ на изменения скорости фотосинтеза, которые влияют на мощность источника или снабжение ассимилятами (Heitholt et al., 1986; Vega et al., 2001; Эгли, 2005). Однако наблюдаемое увеличение числа абортов семяпочек и снижение жизнеспособности пыльцы опровергает возможность того, что все репродуктивные фенотипы, демонстрируемые растениями AS, были следствием подавленной фотосинтетической способности. Соя часто реагирует на условия, которые изменяют фотосинтетические характеристики, отношения источника и поглотителя или ассимилируют снабжение во время цветения или всей репродуктивной фазы, регулируя прерывание цветков или завязывание стручков, а не количество семян на стручок и прерывание семяпочек в развивающихся стручках.Стресс засухи, переохлаждение, дефицит марганца, дефолиация и затенение всех поврежденных стручков и семян сои (Heenan and Campbell, 1980; Musser et al., 1986; Frederick et al., 1991; Board et al., 1995; Liu et al. др., 2003; Эгли, Брюнинг, 2005). Однако, в отличие от гена GmAOX2b AS, эти условия не изменяют количество семян на стручок, предполагая, что частота абортов яйцеклеток также остается неизменной. Обогащение Light и CO ₂ , условия, которые увеличивают стручок сои и завязываются семена, также не изменяют количество семян на стручок (Mathew et al., 2000; Ziska et al., 2001). Кроме того, эксперимент по ручному опылению также продемонстрировал, что у сои, подвергшейся водному стрессу, снижение фотосинтетических характеристик не было связано с нарушением фертильности пыльцы (Kokubun et al., 2001).

GmAOX2 легко обнаруживался в листьях сои дикого типа, выращенной в нормальных условиях. Напротив, белок АО практически не обнаруживался в листьях арабидопсиса дикого типа, риса или табака, выращенных в аналогичных условиях (Vanlerberghe et al., 1994; Абэ и Торияма, 2003; Умбач и др., 2005). Следовательно, в последних исследованиях необходимо было проанализировать эффекты генов AOX AS у растений, подвергшихся воздействию холода (Vanlerberghe et al., 1994) или обработки KCN (Umbach et al., 2005), или путем скрининга предполагаемых каллусов AS (Abe и Торияма, 2003). Относительно высокое содержание белка АОХ в ткани листьев сои предполагает большее участие АО в росте и развитии сои по сравнению с тремя другими видами. Это может объяснить фенотипы роста и фертильности, наблюдаемые у AOX-репрессированных соевых бобов, но не у AOX-репрессированных Arabidopsis (Umbach et al., 2005; Watanabe et al., 2008), рис (K. Toriyama, личное сообщение) или табак (Vanlerberghe et al., 1994). Более активное участие АО в росте и развитии сои может также объяснить неспособность идентифицировать растения AS с полным подавлением GmAOX2b. Даже у AOX AS Arabidopsis (Umbach et al., 2005), табака (Vanlerberghe et al., 1994) и риса (Abe and Toriyama, 2003) растения, полностью лишенные AOX, восстанавливались редко. Важно отметить, что умеренного снижения белка AOX, полученного в сое AOX AS, было достаточно, чтобы снизить эффективность фотосинтеза, ослабить плодовитость растений и нарушить развитие и функцию гаметофитов.В целом, эти результаты согласуются с гипотезой о том, что пороговое количество белка АОХ необходимо для жизнеспособности растительных клеток (Umbach et al., 2005).

Таким образом, наши данные о сое AOX AS показывают, что AOX важен для поддержания фертильности растений и нормального развития и функции гаметофитов. Интересно, что роль АО в половом размножении растений ранее была хорошо известна только у термогенных видов, которые продуцируют чрезвычайно большое количество белка АОХ в репродуктивных тканях.Анализ эффектов репрессии АОХ у других нетермогенных видов, которые экспрессируют белок АОХ в гораздо меньших, но все же легко обнаруживаемых количествах при нормальных условиях роста, должен помочь прояснить и лучше определить роль АО в фертильности и гаметофитной пригодности растений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал трансгенных растений и условия роста

Полноразмерная кДНК GmAOX2b (Finnegan et al., 1997; GmAOX2b первоначально была названа GmAOX3 , была вырезана как единичный нижележащий фрагмент GmAOX3 ) была вырезана промотора 35S вируса мозаики цветной капусты в pCAMBIA1301 (CAMBIA).Ориентация AS вставки относительно промотора 35S была подтверждена секвенированием ДНК.

Конструкция GmAOX2b AS была введена в соевые бобы ( Glycine max ) посредством биолистики (PDS-1000 / He Particle Delivery System; Bio-Rad Laboratories). Протоколы трансформации, отбора и регенерации растений были описаны ранее (Simmonds, 2003). Вкратце, пролиферативные эмбриогенные культуры сои cv X5 (X2650-7-2-3; Simmonds and Donaldson, 2000) были кобомбардированы с GmAOX2b AS и конструкциями генов устойчивости к гигромицину.Трансгенные объекты отбирали и поддерживали на 55 мг L ^-1 гигромицина. Вырезанные зародыши созревали на среде без антибиотиков, осушались воздухом и конвертировались на твердой среде B5 (Gamborg et al., 1968). После переноса в почву растения, обозначенные как поколение T0, выращивали в камере для выращивания с контролируемой средой. Растения T0, несущие ген GmAOX2b AS, были идентифицированы с помощью ПЦР и внесены в семена. Растения, полученные из этих семян (поколение T1), были предшественниками растений, использованных в этом исследовании.

Семена проращивали, и растения выращивали по одному на горшок в 3 л коммерческой горшечной смеси (SSM2500 Potting Mix 2; Richgro Garden Products) при 25 ° C при естественном дневном свете. Позиции горшков были рандомизированы. Фотопериод был увеличен до 16 часов с дополнительным люминесцентным освещением. Растения поливали через день. Удобрения (Thrive All Purpose Plant Food; Yates Australia) вносили каждые 4 недели. Регистрировали количество семян, полученных с одного растения, и долю прерванных семяпочек (семяпочек, которые не смогли развиться до зрелых семян).

Идентификация

Геномную ДНК экстрагировали из дисков свежих листьев и проводили ПЦР-анализы с использованием коммерческого набора и предоставленных реагентов и протокола (набор для ПЦР REDExtract-N-Amp Plant; Sigma-Aldrich) . Праймерами, использованными для обнаружения кДНК GmAOX2b AS, были AOX3-F и AOX3-R (Finnegan et al., 1997). Параметры термоциклирования: один цикл 95 ° C в течение 3 минут; 40 циклов 95 ° C в течение 30 с, 48 ° C в течение 1 мин и 72 ° C в течение 1.5 мин; и один цикл 72 ° C в течение 10 мин. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом на агарозных гелях.

Иммунодетекция AOX

Неочищенные митохондриальные мембраны получали с использованием модификации метода Day et al. (1985). Приблизительно 1 г листьев самого молодого, полностью разросшегося трифолиолата растений на стадии трех трифолиолатов собирали и гомогенизировали в 3 объемах 300 мм Suc, 25 мм декагидрата пирофосфата натрия, 2 мм динатрия ЭДТА, 1% (мас. / Об.) поливинилпирролидон-10, 1% (мас. / об.) бычий сывороточный альбумин и 20 мМ аскорбат натрия, pH 7.5. Гомогенаты фильтровали через три диска Miracloth (Calbiochem), вставленные в шприц на 10 мл, и подвергали дифференциальному центрифугированию (Day et al., 1985). Выделенные митохондриальные мембраны промывали 300 мМ Suc, 10 мМ TES и 1 мМ Gly, pH 7,5, ресуспендировали в небольшом объеме того же буфера и определяли содержание белка (Peterson, 1977).

Приблизительно 25 мкл г сырого мембранного белка было разделено с помощью SDS-PAGE и перенесено на нитроцеллюлозную мембрану (Protran; Schleicher and Schuell) с использованием устройства полусухого блоттинга (Trans-Blot Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell; Bio-Rad ; Towbin et al., 1979). Блоты исследовали моноклональными антителами против АОХ (АОА; Elthon et al., 1989) или порина. Антитело AOA против AOX распознает консервативный аминокислотный мотив, обнаруженный во всех трех изоформах сои (Finnegan et al., 1999). Вторичные антитела (ECL Anti-Mouse IgG, цельное антитело овцы, связанное с пероксидазой хрена; Amersham Biosciences) использовали для обнаружения хемилюминесценции с использованием коммерческого набора (ECL Western Blotting Detection Reagents; Amersham Biosciences) на пленках (Hyperfilm; Amersham Biosciences).Интенсивность сигналов на иммуноблотах определяли количественно (ImageJ версия 1.36 [http://rsb.info.nih.gov/ij/]; программное обеспечение загружено 7 августа 2006 г.). Образцы из одного и того же набора из четырех нетрансгенных контрольных растений были включены в каждый иммуноблот, чтобы обеспечить прямое сравнение экспериментов.

Измерение фотосинтеза и дыхания

Чистый фотосинтез и дыхание измеряли с помощью газообмена (LI-6400 Portable Photosynthesis System; LICOR) на одном и том же полностью развернутом трехлистнике на главном стебле или на средней ветви растений между 10 утра и 14:00 в яркие солнечные дни через 1 неделю после начала цветения.Измерения проводились при температуре листовой камеры 25 ° C, концентрации CO ₂ в листовой камере 380 мкм моль моль ^-1 и интенсивности света 1500 мкм моль квантов м ^-2 с. ^-1 . Для трех линий сои дефицит давления пара в камере для листа во время измерений составлял 1,83 ± 0,01 кПа (линия 3B10), 1,67 ± 0,01 кПа (линия 6C2) и 1,66 ± 0,08 кПа (линия 6C5). Измерения темнового дыхания проводили после того, как растения накрыли темными полиэтиленовыми пакетами на ночь при 25 ° C.

Дыхание листьев также измеряли с помощью кислородного электрода с использованием полосок листьев (приблизительно 1 мм × 10 мм), вырезанных из самых молодых полностью разросшихся трехлистников основных стеблей между 11 часами утра и 14 часами дня через 1 неделю после начала цветения. Вырезанные полоски листьев (приблизительно 15 мг) инкубировали в темноте в течение 10 минут в буфере для анализа (15 мМ TES и 0,2 мМ CaCl ₂ , pH 7,0; Umbach et al., 2005) перед переносом в стеклянную камеру объемом 4 мл. содержащий насыщенный свежим воздухом буфер для анализа.Поглощение кислорода контролировали с помощью кислородного микроэлектрода (MicroResp EL; Unisense) в темноте при 25 ° C, как описано ранее (Colmer and Pedersen, 2008). Буфер для анализа был дополнен 2,5 мМ KCN для ингибирования пути цитохромоксидазы и 10 мМ SHAM для ингибирования пути AOX. Оптимальные концентрации ингибитора определяли экспериментами по титрованию. Образцы листьев были извлечены из анализа и высушены в печи при 60 ° C в течение 48 часов перед определением сухой массы.

Жизнеспособность пыльцы

Полностью открытые цветки собирали случайным образом с каждого растения в день цветения.После удаления лепестков пыльники намазывали 30 μ L 15% (мас. / Об.) Suc, 0,03% (мас. / Об.) Ca (NO ₃ ) ₂ · 4H ₂ O, и 0,01% (мас. / об.) H ₃ BO ₃ (Salem et al., 2007) на предметном стекле для высвобождения пыльцы. Предметное стекло инкубировали при 30 ° C в темноте в течение 24 часов. Добавляли каплю красителя Александра (Alexander, 1969) и все пыльцевые зерна исследовали под световым микроскопом. Пыльцевое зерно оценивалось как проросшее, если длина пыльцевой трубки превышала диаметр пыльцевого зерна.Пыльцевые зерна, которые не прорастали, но были окрашены в зеленый или светло-красный цвет пятном по Александру, оценивались как прерванные (Alexander, 1969), а те, которые окрашивались в красный цвет, оценивались как заполненные, но незатронутые.

Ручное опыление и рост пыльцевых трубок in vivo

Цветы, которые должны были открыться на следующий день, были кастрированы вечером (Fehr, 1980). На следующее утро кастрированные цветы опыляли вручную (Fehr, 1980) пыльцой других цветов того же растения.Неопыленные цветы, которые не опылялись, использовали в качестве контроля. Через 48 часов опыленные вручную цветки вырезали и фиксировали в смеси этанол: ледяная уксусная кислота (3: 1, об. / Об.) В течение 24 часов при 4 ° C. Пестики отделяли от цветков и удаляли трихомы. Пестики очищали в 4 н. NaOH в течение 24 часов при 20 ° C, промывали в деионизированной воде в течение 30 минут, окрашивали обесцвеченным анилиновым синим (0,005% [мас. / Об.] Анилинового синего в 0,05 м фосфата натрия, pH 11) в течение 24 часов. h, установленный в глицерине (Shivanna and Rangaswamy, 1992) и исследованный с помощью флуоресцентной микроскопии (микроскоп Axioplan с объективами Plan-Neofluar Pol, возбуждающий фильтр BP-365/12, светоделитель FT395, барьерный фильтр LP397; Carl Zeiss Australasia).

Статистический анализ

Все статистические анализы были выполнены с использованием Microsoft Excel 2003. Коробчатые диаграммы были подготовлены с помощью программного обеспечения R версии 2.7.0 (http://www.r-project.org/; программное обеспечение загружено 22 апреля 2008 г.) . Тест Стьюдента t использовался для анализа данных, которые были нормально распределены, как определено с помощью теста Лиллиефорса; в противном случае использовали тест Манна-Уитни U .

Благодарности

Мы благодарим Николаса Тейлора за получение моноклональных антител к АОХ; Шерил Хаббард за преобразование сои; Мингрен Ши и Гуйцзюнь Янь за советы по статистике; Эрику Венеклаасу за полезные обсуждения наших данных о фотосинтезе; и Оле Педерсен за предоставление кислородных электродов и помощь во время измерения дыхания листьев.

Footnotes

• ↵1 Эта работа была поддержана Австралийским исследовательским советом (гранты PMF и DAD), международной стипендией для аспирантов от правительства Австралии, Министерства образования, занятости и трудовых отношений, а также Премия аспиранта Университета Западной Австралии (T.-TC).

• Автор несет ответственность за распространение материалов, относящихся к результатам, представленным в этой статье, в соответствии с политикой, описанной в Инструкциях для авторов (www.plantphysiol.org): Патрик М. Финнеган (patrick.finnegan {at} uwa.edu.au).

• ↵ [OA] Статьи в открытом доступе можно просматривать в Интернете без подписки.

• www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.109.149294

• Получено 12 октября 2009 г.
• Принято 19 января 2010 г.
• Опубликовано 22 января 2010 г.

Пред. — применение гиббереллина в цветах винограда сорта Тамнара увеличивает выработку гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) при полном цветении